经过壳聚糖溶液储存的微弧氧化纯钛骨植入体细胞相容性实验研究

何梦乔 许妍 荆凤娟 闫雪莲 焦雪 姜馨晔

摘要：目的 將钛微弧氧化涂层钛片置于不同浓度的壳聚糖溶液中浸泡，对其进行成骨细胞生物相容性检测，评价其生物相容性。

关键词：纯钛;MC3T3-E1细胞;壳聚糖;抗菌性;生物相容性

【中图分类号】R4  【文献标识码】A  【文章编号】1673-9026（2021）14--01

引言

正畸治疗过程中常常会遇到一些疑难病例，比如骨性上颌前突、磨牙高位等，这些复杂的病例往往不能通过普通的托槽矫治解决，这时正畸支抗钉进入应用。本实验主要通过对现有的正畸支抗钉材料进行表面处理，观察其是否拥有更加优良的细胞相容性抗菌性能。以纯钛和钛合金材料制作的医疗器械已经广泛应用于口腔种植、骨折固定、美容植入等领域，随着对口腔植入物表面改性技术的深入发展，一些有机材料如壳聚糖，海藻酸钠等有机质开始成为骨修复材料应用于临床之中。口腔在人体中是一个特殊的复杂成分聚集体。唾液、食物、菌斑，细菌以及其代谢产物的长期混合使得口腔植入物受到感染的风险急剧增大。钛金属本身具有生物惰性，不具备抗菌性，支抗钉周围组织感染是支抗钉手术后失败的主要原因。如何在保持钛支抗钉微弧氧化表面的高生物活性的同时增强其抗菌性，降低感染风险是当今研究的发展方向。

1.材料与方法

实验材料：纯钛微弧氧化钛片150枚φ=10mm，厚1mm。对照A 组：纯钛微弧氧化钛片50枚。实验B组：纯钛微弧氧化-壳聚糖低浓度（1.5g/L）浸泡处理钛片50枚。实验C组：纯钛微弧氧化-壳聚糖高浓度（3g/L）浸泡处理钛片50枚。所有钛片都经酒精浸泡过夜后紫外线照射30min，每面重复照射3次。

1.1细胞培养

MC3T3-E1（小鼠颅顶前骨细胞亚克隆）细胞购，将冻存的细胞复苏：从液氮罐中取出冻存管，迅速置于37℃水浴中升温，2分钟后取出不断摇动使其融化。75%乙醇溶液消毒管外壁，置于超净台中。吸出细胞悬液加入5ml培养液，1000r/min离心5min，弃上清。加入培养液吹打混匀，置于培养箱里中培养，待细胞长至70%～80%，传代培养，备用。

1.2细胞黏附性实验

待细胞铺满70%～80%瓶底，用0.25%的胰酶进行消化，细胞计数。将A、B组试件铺在24孔板内，每种处理方式3个复孔。接种细胞数为2×104/孔，分别培养30min、60min、90min、120min，弃去上清液，PBS冲洗3次，加入无血清的培养基和CCK-8溶液，继续孵育4h，吸取上清液转移到96孔板中，酶标仪检测450nm吸光度值，求平均值并绘制三线表。

1.3细胞增殖性实验

用0.25%的胰酶进行消化，将A、B组试件铺在24孔板内，每种处理方式3个复孔。细胞数为5×103/孔，分别培养2、4、6天，弃去上清液，PBS冲洗3次，加入无血清的培养基和CCK-8试剂，继续孵育3h，避光条件下吸取上清液转移到96孔板中，酶标仪检测吸光度值，求平均值并绘制柱状图。

1.4统计学分析

选用SPSS20.0 统计软件分析，数据用平均值±标准差表示，采用重复测量的方差分析，P <0.05 认为差异有统计学意义。

2.结果

2.1CCK-8黏附性实验

如表1所示，应用spss20.0进行重复测量的方差分析：不同处理组之间的差异，F=82.170，P=0.000<0.05，不同时间点的差异，F=495.555，P=0.000<0.05，差别有统计学意义。培养30min、60min、90min、120min时B、C组黏附的细胞密度显著高于A组。且各时间点B、C组生长吸光度值均>A组，说明B、C组黏附情况优于A组。

2.2CCK-8增殖性实验

如表2所示，采用SPSS20.0统计软件对总体数据进行分析，具体方法用重复测量的方差分析，不同处理组组间采用LSD的两两比较。数据以均数土标准差表示， 检验水准a=0.05。三组细胞数量均随着时间的延长而增加，不同处理组之间的差异，F=133.168，P=0.000<0.05，不同时间点的差异，F=364.946，P=0.000<0.05，差别有统计学意义。C组试件表面细胞吸光度值显著大于A、B两组，说明C组试件表面细胞增殖状况最佳。

采用SPSS20.0统计软件对总体数据进行分析，具体方法用重复测量的方差分析，不同处理组组间采用LSD的两两比较。不同处理组之间的差异F=101.806，P=0.000<0.05，差别有统计学意义。不同时间点的差异，F=607.654，P=0.000<0.05，差别有统计学意义。3组试件表面成骨细胞活性均随着时间增大，第3、5天，C组成骨细胞ALP活性优于AB两组，显示高浓度壳聚糖涂层有利于细胞分化。

3讨论

在黏附实验中B、C两组在吸光度数值上差别不甚显著。实验中B、C两组试件表面的黏附率均大于单纯的微弧氧化表层。细胞的增殖能力能够反应出细胞的整体生物功能特性，在增殖实验中，C组的试件表面增殖率显著高于B、A两组，碱性磷酸酶实验中，C组碱性磷酸酶活性显著高于B、A两组，说明在细胞增殖过程中高浓度组细胞生命活动的细胞生物化学反应更强。

壳聚糖等多糖基物质可预防疾病的发生，抑制多种细菌的聚集;壳聚糖本身能够促进细胞的增殖和黏附，还具有良好的抑菌作用，也可在多糖材料特定效能的协助下持久有效发挥黏结、抗菌、再生等效果。此外，多糖也可在体内酶解产生单糖，作为细胞生长的能源物质利于组织修复。壳聚糖作为多糖材料中一种较为重要的物质，因其分子中带有游离氨基，这些氨基通过结合负电子来抑制细菌：壳聚糖的多聚阳离子易与真菌细胞表面带负电荷的基团作用，从而改变病原菌细胞膜的流动性和通透性;干扰DNA的复制与转录;阻断病原菌代谢。壳聚糖作为一种多糖类也具备较高的生物相容性与良好的生物降解速率。壳聚糖作为细胞外基质分泌的诱导剂能使软骨细胞易于黏附在壳聚糖表面，相比与其他多糖化合物而言壳聚糖则是甲壳素脱乙酰之后的物质，它的特殊性在于其分子链带有正电荷从而使得壳聚糖成为自然界中独一无二的具有活性氨基（-NH2）的聚阳离子弱碱性多糖，因此也这使得该材料易于结合带负电荷的细菌细胞壁并附着于 DNA，从而抑制细菌的复制。

4结论

本研究结果表明：3组材料均具有良好的生物相容性，其中纯钛微弧氧化-高浓度壳聚糖浸泡处理的涂层对于细胞的黏附、增殖以及碱性磷酸酶表达均有显著的促进作用，说明壳聚糖浸泡有利于植入的钛支抗材料的初期稳定性以及早期矿化，是一种理想的植入物储存材料。

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