丙烯酰化壳聚糖的制备

郑德铭 姜芮 胡嘉伟 王玲

摘      要：设计了一种壳聚糖的改性方法。以壳聚糖（CS）和丙烯酸（AA）为原料，1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）为交联结合剂， 用丙烯酰化的方式改性壳聚糖，并成功地通过红外光谱法和核磁共振氢谱法测定粒子微观组成，验证了丙烯酰化壳聚糖的合成。得到带有碳碳双键的丙烯酰化交联壳聚糖，可以用于进一步制成微凝胶，微球可以同药物一起被加工成丸剂、乳剂、微球、微囊、薄膜等制成控制释放体系，达到控制药物释放、延长药物疗效的作用。

关  键  词：壳聚糖;丙烯酸;丙烯酰化

中图分类号：O636.1       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2019）09-1983-04

Abstract： A modification method of chitosan was designed. Using chitosan （CS） and acrylic acid （AA） as raw materials and 1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide hydrochloride （EDC） as cross-linking agent， chitosan was modified by acrylation. The synthesis of acrylic chitosan was successfully verified by infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy. The acrolein crosslinked chitosan with carbon and carbon double bonds can be used for further preparation of microgels. Microspheres can be processed into pills， emulsions， microspheres， microcapsules and films together with drugs to control the release system， so as to control drug release and prolong the efficacy of drugs.

Key words： Chitosan; Acrylic acid; Propylene acylation

殼聚糖，呈半透明片状或粉末状固体，颜色为白色或淡黄色，略有珍珠光泽;它无味、无臭、无毒性，纯壳聚糖略带珍珠光泽。分子量由构成的材料而定。具有良好的吸附性、成膜性和通透性、生物相容性、成纤性、吸湿性和保湿性， 具有优良的的止血和抑菌消炎作用， 且无副作用。壳聚糖具有生物可降解性， 且无有害降解物，十分适合于裸露、需要保护的创面材料。壳聚糖的结构属于二塘，其基本单位是氨基葡萄糖，其结构基元为壳二糖，壳聚糖的结晶度较高，因此具有稳定的物理性质。它还是甲壳素的一级衍生物，其化学结构为带阳离子的高分子碱性多糖聚合物。甲壳素在自然界的来源十分广泛，具有非常丰富的自然资源[1]。由于甲壳素和壳聚糖不易溶于水这一特质，在早些年人们没能意识到它的价值，大多的甲壳素和壳聚糖都当做废料处理，在给环境造成污染之外，还造成了自然资源的浪费。通过甲壳素得到壳聚糖的方法有很多，现在使用最多的低分子量的壳聚糖的制备方法主要有化学降解法、酶降解法、生物降解法。目前， 以酶解法为主。酶降解法比化学降解过程更具有优势， 因而酶降解法的使用要更加广泛，酶降解法可选择性地使壳聚糖的β-（1， 4）糖苷键断裂，进而可以很容易的控制降解产物的分子量和降解过程， 因而可以方便监控，得到所需分子量的低聚壳聚糖;酶降解法优于其他两种方法，不需要使用大剂量的反应试剂， 对环境污染较少，反应条件比较温和，不发生副反应，工艺比较容易控制。

酶降解法是通过专一性酶对甲壳素进行脱乙酰基反应制得壳聚糖，使用酶降解法制备壳聚糖要获得甲壳素脱乙酰酶。到目前为止，有30多种酶可以用于制备壳聚糖，如甲壳素酶、壳聚糖酶和脱乙酰酶，并且已经发现许多微生物、真菌中均有脱乙酰酶的存在。许多微生物具有生物降解作用，通过自身几丁质酶、壳聚糖酶、甲壳素乙酰酶等的合成，甲壳素降解可产生不同分子量的壳聚糖，根据甲壳素、壳聚糖及其水解酶的特异性、亲和力，用几丁质酶-复合壳聚糖-金合物为控制针位置检测含有甲壳素和壳聚糖的生物，有助于研究细胞化学的定位，同时利用生物发酵降解，减少环境污染，且产物稳定。

化学降解法就是用化学物质对壳聚糖进行脱乙酰基反应的方法。壳聚糖是甲壳素脱乙酰产物， 甲壳素是酰胺类多糖， 壳聚糖制备过程是酰胺的水解过程。酰胺可在强酸或强碱条件下水解， 对于低分子的酰胺， 水解可进行得比较完全， 但是对于多糖来说， 强酸更容易水解糖苷键， 所以甲壳素的脱乙酰基， 一般不采用强酸水解;相对来说， 强碱造成糖苷键的断裂不像强酸那么严重， 所以都用强碱来脱乙酰基。近年来，有学者发现壳聚糖脱乙酰基后能溶于水和稀酸溶液[2]，并且具有许多优异的特性， 壳聚糖所受关注度越来越高，壳聚糖的研究也日益增多。世界各国的科学家对壳聚糖的改性的研究越来越感兴趣。壳聚糖在食品、金属提取及回收、果蔬保鲜方面、在化妆品中的开发与应用方面[3]、在环保方面[4]、作为抗癌药物的缓释载体等方面有着广泛的应用[5]。利用壳聚糖得到的产品功能很多，性能很好，如通过制备壳聚糖等化妆品、洗面奶、苔藓等已上市。由于它是一种天然的生物大分子，渗透后膜的保温性、绝缘性和抗衰老化、抗皱、美容保健等功能是其他材料无可比拟的。在环保领域壳聚糖可用于污水处理，蛋白回收，水净化等。这是由于壳聚糖分子中含有羟基、氨基等官能团， 这些官能团可以彼此之间形成氢键也或盐键，形成具有类似网状结构的笼形分子， 这种笼形分子可以与金属离子发生络合，从而除去水中的金属离子。壳聚糖是以甲壳质为原料，再经提炼而成，不溶于水，能溶于稀酸，这就限制了它的应用。近年来，人们使用各种方法对其进行改性开发它的潜在价值。如溶解改性、酰化反应改性 、羧甲基化反应改性、烷基化反应改性、接枝反应改性、与环氧化合物反应改性、与杂环化合物反应改性[6]等。本文采用的方法是丙烯酰化，酰化又称酰基化，是指在有机分子中的氮、氧、碳或硫等原子上引入脂肪族酰基RCO-或芳香族酰基ArCO-的反应。丙烯酰化属于N-酰化，伯胺基或仲胺基上的氢被酰基取代生成酰胺的过程。其反应机理为亲核取代反应机理，壳聚糖作为反应的亲核试剂，与羧酸酰基化试剂反应，生成酰胺键。我们用丙烯酸对壳聚糖进行改性，以EDC为生物结合剂来进行反应。EDC（或者叫EDAC;1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐）是用于结合含有羧酸盐和胺的生物物质的最普遍的碳二亚胺。在实际上，它是最频繁使用的交联剂，也是最普遍使用的生物结合试剂。EDC是水溶性的，可以直接加入到反应中，而无需预先溶于有机溶剂，其本身和交联副产物的异脲都是可溶于水的，因此可以通过透析和凝胶过滤的方法很简单的除去。大量的EDC化学品应该在零下20 ℃下贮存干燥。EDC在水的存在下是不稳定的，为防止随着时间的推移造成试剂分解凝结，再打开瓶子之前要将瓶子温度升高到室温。我们就这样制备丙烯酰化壳聚糖，为下一步合成微凝胶做准备，比如与N-异丙基丙烯酰胺合成温敏性微凝胶[7]。

1  实验部分

1.1  试剂

壳聚糖（CS），丙烯酸（AA），1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC），冰醋酸（CH3COOH），重水（D2O），氘代乙酸（CD3COOD），均为分析纯，产地为国药化学试剂有限公司。

1.2  仪器

玻璃恒温水浴，SYP，巩义裕华仪器有限责任公司;电子天平，CAV214C，沈阳杰龙仪器有限公司;循环水真空泵，SHZ-DⅢ，巩义裕华仪器有限责任公司;集热式磁力加热搅拌器，DF-Ⅱ，金坛市医疗仪器厂;数控超声波清洗器，KQ-300DE，昆山市超声仪器有限公司;电热鼓风干燥箱，DHG-9140A，上海精宏实验仪器有限公司;冷冻干燥机，FD-1C-50，北京博康实验仪器有限公司;动态光散射（DLS），ELS-Z， OTSUKA， Japan;透射电子显微镜，JEM-100CXⅡ，日本电子株式会社;傅里叶红外光谱仪，NEXUS470，美国热电尼高力公司。

1.3  实验方案

首先，在室温下向500 mL的四口烧瓶中加入0.895 g丙烯酸和200 mL二次蒸馏水，待其完全溶解，再加入2 g壳聚糖，放入转子。开启集热式磁力加热搅拌器，打开搅拌按钮，设置转速为3～4 r/min，搅拌20 h。安装实验装置，在室温下，将2.619 g EDC溶于50 mL的二次蒸馏水中，然后向500 mL四口烧瓶中加入依次预先备好的壳聚糖和丙烯酸溶液、溶解好的EDC溶液，开启置顶式搅拌器，设定搅拌速度为200 r/min，将四口瓶移入25 ℃的恒温水浴锅内，然后通入高纯度的氮气，排除体系内的氧气，密闭反应体系，并在此条件下反应2 h。反应结束后，将得到的液体进行透析，透析一周，前3天一天换三次水，后4天一天换两次水。之后进行测试观察结果，即得到丙烯酰化壳聚糖，可以进行下一步反应。反应方程式如图1所示。

2  分析测试

2.1  红外光谱（FT-IR）分析

将得到的样品，取少量放到表面皿里，然后放进冷冻干燥机进行，将冷冻干燥的固体溴化钾粉末按照约1∶200的比例混合研磨，然后进行压片，将得到的片状样品放入红外光谱仪中进行测定。

2.2  核磁氢谱（1H-NMR）分析

将得到的混合物，放到表面皿里，进行冷冻干燥，然后称量6～8 mg样品，加入600 mL D2O、50 mL CD3COOD摇匀，采用数控超声波清洗器溶解壳聚糖，待完全溶解后，再加入核磁管中进行测量。

3  结果讨论

3.1  FT-IR分析

将壳聚糖粉末与溴化钾粉末按照约1∶200的比例混合研磨， 然后进行压片，将得到的片状样品进行FT-IR测试，对数据整理后，得到图2。

将制得的CS/AA，经离心后，取少量放到表面皿里，进行冷冻干燥，将冷冻干燥的固体溴化钾粉末混合研磨，然后进行压片，将得到的片状样品 进行FT-IR测试，对数据整理后，得到图3。

从图3中可以看出CS/AA的FTIR谱图中含有CS的所有特征峰，如CS在3 434 cm-1处的羟基和氨基吸收峰，在2 845 cm-1处的甲基和亚甲基的伸缩振动峰，以及1 075 cm-1处葡萄糖环的C-O-C伸缩振动吸收峰，这些吸收峰在CS/AA樣品的FT-IR谱图中出现，说明制得的样品中含有壳聚糖。CS/AA样品的FT-IR谱图中出现了1 643 cm-1处的C=C的伸缩振动吸收峰，说明AA接枝到了CS上，合成了丙烯酰化壳聚糖的合成。结果证实所合成的高分子由CS和AA组成。

3.2  1H-NMR核磁分析

如图4所示，δ=4.64 ppm对应于糖环异头碳的质子峰（a峰），δ=3.24～3.76 ppm对应于糖环b位置的质子峰，δ=2.87 ppm对应于糖环c位置（-CH-NH2）的质子峰，δ=1.75 ppm（CH3-CO-）对应于乙酰基质子的吸收峰，说明壳聚糖未完全脱乙酰化。

由图5可知，CS/AA的1H NMR谱图与CS的的1H NMR谱图的形状基本相似，同时，在化学位移δ=3.24～3.76 ppm（b，峰）和δ=2.87 ppm（c，峰-CH-NH2，）是两图的共有质子峰，说明CS/AA的1H NMR谱图中包含有CS谱图的质子峰。在化学位移δ=2.5 ppm（d，峰，CH3-CO-）随着反应的进行是有d峰发生了较小的偏移。

本实验制备核试样所用溶剂为氘带乙酸，在图中，化学位移δ=1.86 ppm处为氘带乙酸所对应的溶剂峰;在化学位移δ=6.14～6.23 ppm（e峰）的吸收峰代表反式-CO-CH=CH2的质子峰，在化学位移δ=5.81～5.54 ppm（g峰）对应于顺式-CO-CH=CH2的质子峰;δ=6.15～5.90 ppm（f峰）对应于-COO-CH=CH-的质子峰。

4  结 论

首先在室温下将壳聚糖和丙烯酸溶解，然后在氮气的保护下，在EDC的作用下成功合成了丙烯酰化壳聚糖。用红外光谱法表征和核磁氢谱法表征了粒子的微观组成，证明了CS/AA中有CS和AA两种主要成分的存在以及产物中含有碳碳双键，从而证明了丙烯酰化壳聚糖的合成。

参考文献：

[1]叶光辉. 壳聚糖的应用研究进展[J].广州化工，2015，43（02）：21-22.

[2]黄永春， 李琳， 郭祀远.壳聚糖酶解的研究[J].化工进展，2002， 21（6）：381-385.

[3]郭振楚.甲壳素研究进展[J].日用化学工业，1997（2）：29～30.

[4]唐兰模.用壳聚糖除去溶液中微量铬（VI）的研究[J].化学世界，2001， （2）：59.

[5]Agnihotri S A，Mallikarjuna N N，Aminabhavi T M.Recent advances on chitosan-based micro-and nanoparticles in drug delivery[J]. Journal of Controlled Release，2004，100（1）：5-28.

[6]夏文水，陈洁.甲壳素和壳聚糖的化学改性及其应用[J] .无锡轻工业学院学报，1994，13（2）：162-164.

[7]任淑萍， 周芳名， 常成明. 温敏性微凝胶的合成[J]. 当代化工， 2015（12）： 28.