清化饮对慢性胃炎脾胃湿热证模型大鼠miR155/SOCS1介导的炎症通路的作用机制研究

王薇 徐丛荣 任彦 王施玮 廖春丽 付肖岩 胡海霞

摘要：目的基于miR-155/SOCS1炎癥通路研究清化饮对慢性胃炎脾胃湿热证治疗作用的机制研究。方法将60只Wistar大鼠随机分为对照组、脾胃湿热模型组、清化饮组，采用湿热环境+高脂高糖饮食+白酒的造模方法建立脾胃湿热证慢性胃炎大鼠模型，清化饮连续灌胃给药20 d。治疗结束后处死大鼠，腹主动脉取血并留取胃组织，HE染色观察胃组织病理改变情况，应用ELISA检测血清TNF-α、IL-6的含量，应用RT-PCR法检测miR-155及其靶基因SOCS1的表达水平，应用免疫组化实验检测转录因子NFκB p65及SOCS1的蛋白表达水平。结果与对照组比较，脾胃湿热模型组大鼠胃组织炎症细胞浸润增多，且miR-155的表达量明显上调，其靶基因SOCS1显著下调，导致炎症通路关键的转录因子NFκB p65核内表达水平及血清TNF-α、IL-6的生成显著上升。而与模型组比较，清化饮可降低胃组织炎症细胞的浸润和miR-155的表达水平，并且使NFκB p65的核内表达水平降低，同时上调SOCS1表达，进而降低TNF-α、IL-6的分泌水平。结论清化饮可通过miR-155/SOCS1通路抑制NFκB活化及过度炎症反应保护胃组织，为临床治疗慢性胃炎脾胃湿热证提供基础理论依据。

关键词：清化饮;慢性胃炎;脾胃湿热模型;miR-155;炎症通路.

The study of regulation of Qinghuayin on the rat model of spleen stomach damp heat syndrome of chronic gastritis via miR-155/SOCS1 mediated inflammatory pathway

Wang Wei1，Xu Congrong1，Ren Yan1，Wang Shiwei1，Fu Xiaoyan1，Liao Chunli1，Hu Haixia2，3

1 The Second Affiliated Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou，Fujian，350003，China

2 Academy of Integrative Medicine，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou，Fujian 350122，China

3 Fujian Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatrics，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou，Fujian 350122，China

Abstract：Objective To study the therapeutic mechanism of Qinghuayin on spleen and stomach dampness-heat syndrome of chronic gastritis via miR-155/SOCS1 mediated inflammatory pathway.Methods 60 Wistar rats were randomly divided into control group，spleen stomach damp heat model group and Qinghuayin group.The wet heat environment plus a high-fat and high-sugar diet was used to establish a rat model of dampness-heat syndrome of the spleen and stomach，and Qinghuayin was continuously intragastric administered for 20 days.After treatment，the rats were executed and then the blood of abdominal aorta was taken and the gastric tissue was retained for analysis.HE staining was used to observe the pathological changes of gastric tissue，the serum TNF-αand IL-6 was detected by ELISA.The expression level of miR-155 and its target gene SOCS1 was detected by RT-PCR，the protein expression levels of NFκB p65 and SOCS1were detected by immunohistochemistry.Results Compared with the control group，the infiltration of inflammatory cells were increased significantly in gastric tissue of rats with dampness-heat syndrome of the spleen and stomach model group，the expression of miR-155 was significantly up-regulated，and its target gene SOCS1 was significantly down regulated，resulting in the increased expression level of transcription factor NFκB p65 in nucleus and SOCS1，and the production of TNF-αand IL-6 increased significantly in rat serum.However，Qinghuayin can reduce the infiltration of inflammatory cells and the expression level of miR-155 in gastric tissue，and reduce the nuclear expression level of NFκB p65 decreased，up-regulated the expression of SOCS1，thereby reducing the secretion level TNF-αand IL-6 comparing with model group.Conclusion Qinghuayin can inhibit NFκB activation through miR-155/SOCS1 pathway and excessive inflammatory reaction，protecting gastric tissue from damage and providing basic theoretical basis for clinical treatment of spleen and stomach dampness-heat syndrome of chronic gastritis.

Key words：Qinghuayin;Chronic gastritis;spleen and stomach dampness-heat syndrome;miR-155;Inflammatory pathway

【中图分类号】R573  【文献标识码】A  【文章编号】1673-9026（2021）14--03

慢性胃炎病症表现为纳差、嘈杂、烧心等症状，在中医划归为“胃脘痛”“痞满”等疾病范畴，其临床治疗目前无特效药物，长期使用西医治疗会造成耐药，治疗效果不佳且易复发。慢性胃炎发病多会累及脾，脾胃湿热是其最为常见的证型[1，2]。脾胃湿热证的脾胃组织存在大量炎症浸润，其发病机制与炎症病变密切相关。局部的过度炎症反应将导致脾胃组织的损伤迁延难愈，因此针对炎症反应的治疗将有效地改善慢性胃炎的临床症状[3]。目前已证实非编码单链小RNA miR-155（microRNA-155）是调控免疫炎症反应的关键小RNA之一，主要通过调控其下游基因SOCS1（suppressors of cytokine signaling）抑制炎症反应的进展[4]，因此miR-155/SOCS1是是调控炎症反应的一个关键炎症通路。清化饮是我国杨春波国医大师治疗慢性胃炎脾胃湿热证的经验方，具有健脾清热的效果。前期研究已证实清化饮对慢性胃炎炎症反应具有确切的临床疗效[5]，因此，本研究将从信号通路miR-155/SOCS1水平进一步揭示清化饮治疗慢性胃炎脾胃湿热证的分子作用机制，将有助于疾病的早期诊断和治疗。

1实验材料

1.1实验动物选取6-8周龄，SPF清洁级Wistar大鼠60只，体重为220-250 g[上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SYXK（闽）2019～0007]。

1.2主要试剂清化饮（闽药制字Z05104030）购于福建中医药大学附属第二人民医院;IL-6 ELISA检测试剂盒（批号：F15870）、TNF-αELISA检测试剂盒（批号：F16960）购自上海西唐生物科技有限公司;RT-PCR试剂盒（批号：DRR036A）购自大连TaKaRa公司;RIPA裂解液（批号：P0013B）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：P0010S）、超敏ECL化学发光检测试剂盒（批号：P0018FM）均购自碧云天生物技术有限公司，SOCS1（批号：3950）、NFκB p65（批号：6956）、羊抗兔HRP IgG（批号：91196）购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.3主要仪器

旋转蒸发器（型号：RE-520A，上海亚荣生化仪器厂）;奥林巴斯显微镜（型号：BX51T-PHD-J11，日本奥林巴斯公司），酶标仪（型号：ELX808，美国BioTek公司），荧光定量PCR仪（型号：7500，美国ABI公司），凝胶成像分析系统（型号：ChemiDoc XRS+，美国BioRad公司）。

2实验方法

2.1藥物制备

清化饮的药物组成：茵陈9 g、薏苡仁20 g、厚朴6 g、生扁豆12 g、黄连3 g。将药物先泡30 min，加蒸馏水量约为药量的8倍，煎煮3次，煎煮中用冷凝管收集蒸汽中挥发性的药物成分，将3次药汁混合，离心取澄清药汁，配制成1.0 g/ml浓度药液，4℃冰箱中保存备用。

2.2造模与干预治疗

大鼠适应性饲养1 w后，随机分成3组，分别为对照组，脾胃湿热模型组，清化饮治疗组，每组20只。采用湿热环境+高脂高糖饮食+白酒的造模方法建立脾胃湿热证慢性胃炎大鼠模型：饲以高脂高糖饮食（高糖高脂饲料普通饲料中混入12%猪油、8%蜂蜜加工而成），并与油脂隔日交替灌服白酒2 ml/200 g大鼠，共10 d，然后放入人工气候箱中，温度为32±2℃，相对湿度为95%，共5 d。对照组普通饲料喂养，清化饮治疗组于造模后给予清化饮灌胃治疗21 d，1次/d。给药期间自由进食、饮水。每天观察其一般情况，记录精神状态、进食、活动和大便情况。

2.3标本采集

取材前禁食24 h。腹主动脉采血5 mL，静置后以3000 r/min离心15 min，取上层血清置于EP管中，于-80℃冰箱中保存待测。脱颈处死后取胃组织，置于液氮中冷冻保存备用。

2.4胃黏膜组织病理学观察

制备组织石蜡切片，将制备好的石蜡切片用梯度酒精依次进行脱蜡处理后，苏木素染色5～10 min，流水冲洗观察效果，可进行复染。伊红染色约30 s，流水冲洗，也可复染，即可于普通光镜下进行观察拍照。

2.5炎症因子检测

取离心后的血清，按照ELISA试剂盒说明书检测血清中的炎症因子，并依据标准曲线计算IL-6、TNF-α的含量。

2.6 RT-PCR法检测miR-155 mRNA、SOCS1 mRNA的表达水平

将胃组织用剪刀剪碎并将其置于装有液氮的离心管中，先加入200μl Trizol，用高温灭菌的玻璃研磨棒磨至细腻，然后再加入800μl Trizol，用枪头吹打溶解后提取组织总mRNA并计算其浓度。先进行cDNA逆转录后，再行实时荧光定量PCR。引物序列为：miR-155：F，5’-TATCAACACCACCTGCGACC-3’;R，5’-ACTCGGTCAGAAAGCCAGTG-3’;SOCS-1：F，5’-GGAGTCTGTGCTCTG GGATT-3’，R，5’-TGAG GGAGTGAAGGAGCAAC-3’。反应体系为：95℃10 min，95℃15 s，58℃60 s扩增35个循环，采用2-△△Ct法计算各基因的相对表达量。

2.7免疫组织化学法观察胃组织SOCS1、NFκB p65的表达水平

取胃组织，制备蜡块，并包埋切片备用。将切片放入0.01 M柠檬酸盐缓冲液（PH 6.0）中，在微波炉内微波辐射10 min，待修復液降至室温后，PBS（0.1 M）洗3次。切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20 min。在切片上滴加炎症相关蛋白（SOCS1、NFκB p65）一抗，4℃过夜孵育，PBS（0.1 M）洗3次。在切片上滴加生物素化第二抗体（IgG），37℃孵育20 min，PBS（0.1 M）洗3次。在切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP），37℃孵育20 min，PBS（0.1 M）洗3次。使用DAB显色试剂盒进行显色，显微镜取五个不同视野进行观察并拍照后，计算单位面积内的阳性细胞数。Image J软件分析实验结果。

2.8统计学方法

数据均以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，运用SPSS 22.0软件进行统计分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

3结果

3.1动物一般状况

空白对照组小鼠精神状态良好，皮毛有光泽，反应灵敏，活动自如，大便正常。脾胃湿热模型组小鼠出现嗜睡懒动，反应迟钝，皮毛无光泽，大便溏腻等表现。清化饮灌胃治疗后，上述症状逐渐改善。

3.2大鼠胃黏膜组织病理改变情况

与对照组相比，脾胃湿热证模型组腺体肿大排列不齐，且出现明显的炎症细胞浸润，清化饮组与模型组相比较，胃部腺体排列变齐，炎症细胞浸润等病理改变有所缓解。见图1。

注：CTR：对照组;Model：脾胃湿热模型组;QHY：清化饮组。

图1大鼠胃粘膜组织HE染色情况（200×）

3.3清化饮对脾胃温热症模型大鼠外周血清中炎症因子含量的影响

与对照组比较，脾胃湿热模型组外周血中的IL-6、TNF-α释放量显著升高，提示脾胃湿热证大鼠体内炎症因子含量升高;与脾胃湿热模型组比较，清化饮可显著降低IL-6、TNF-α释放量，差异有统计学意义（见表1）。结果表明，清化饮能显著降低炎症因子的含量，减轻胃部炎症反应。

3.4清化饮对脾胃温热症模型大鼠中miR-155及其靶基因表达水平的影响

结果表明，清化饮能够抑制脾胃湿热模型中miR-155的表达，同时促进其靶基因SOCS1的表达升高，进而抑制下游炎症因子表达及胃部炎症所致的组织损伤，见图2。

注：CTR：对照组;Model：脾胃湿热模型组;QHY：清化饮组。与对照组比较，*P<0.05;与脾胃湿热模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3.5清化饮对脾胃温热症模型大鼠中炎症通路蛋白表达水平的影响

SOCS1及NFκB p65是炎症通路中抑制炎症因子表达的关键蛋白。如图3，清化饮能够升高SOCS1的蛋白表达水平，同时使胞核内NFκB p65的蛋白表达下调，提示清化饮同时能抑制p65核移位，这可能是缓解胃组织炎症损伤的原因之一。

注：CTR：对照组;Model：脾胃湿热模型组;QHY：清化饮组。与对照组比较，*P<0.05;与脾胃湿热模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

4讨论

中医学认为脾胃是人体后天之本，人体受到湿热侵犯后，中焦脾胃是病变部位。脾胃湿热证是常见的临床实性证候，多因湿邪入侵、长时间饮食不合理、情绪失调、脾胃禀赋不足而损伤脾胃，出现脾气下降，胃气上升相关症状，在福建等气候潮湿、高温多雨的地区容易发生[6]。脾胃湿热证在临床治疗时要遵循和胃、醒脾、化湿清热原则。脾胃湿热证的临床表现主要是消化系统的炎症反应，但过度的炎症反应会导致大量炎症细胞浸润胃组织并释放炎症因子，产生严重的炎症反应，导致胃黏膜的结构和功能损伤[7]。

新近研究提示，MicroRNAs是调控炎症反应中发挥着关键作用，它是长度为20-24nt单链小分子RNA，人类基因中约30-90%受microRNAs调控。其中，miR-155调控着炎症反应中炎症相关基因的表达，是一个NF-B p65依赖性miRNA，且基因敲除miR-155后，则NF-B p65将不会发生核移位[8]，可见miR-155在炎症通路中的关键调控作用。炎症反应发生时，miR-155表达显著上调，可靶向抑制SOCS-1，从而使一系列促炎因子如TNF-α，IL-6等生成增多，从而造成组织损伤[9]。

清化饮是我国杨春波国医大师治疗脾胃湿热证的经验方，经多年临床证实，清化饮治疗慢性胃炎脾胃湿热证具有良好的疗效。清化饮由茵陈、生扁豆、黄连、厚朴、薏苡仁、赤芍等组成，方中茵陈性苦微寒，以其善能清热利湿，又因其长于三月独得春升之气，故入肝经兼能上行，为君药;生扁豆味甘性微温，能醒脾化湿;辅以苦寒之黄连清热燥湿;配以辛温之厚朴，化湿理气除满;薏苡仁利水渗湿而健脾;佐以赤芍以清热凉血，散瘀止痛。全方药性平和，药味精，药量轻，寒温并用，共奏清热化湿、理气活血之功。中焦脾胃为枢机之地，湿热之邪阻滞中焦，则中焦气机不通，治法当恢复脾胃生理功能[10]。

既往研究证实，清化饮能提高机体抗氧化的能力并调整免疫功能，改善胃肠功能[11，12]。本研究结果表明，与对照组相比，脾胃湿热模型组的miR-155表达量增高，其抑制其靶基因SOCS1的表达，促使下游炎症因子TNF-α、IL-6含量升高，提示脾胃湿热证能激活过度的免疫炎症反应，炎症加剧还将进一步促使氧化应激发生，从而形成正反馈式的损伤作用，不断地加重胃组织损伤。脾胃湿热模型大鼠经清化饮治疗后，miR-155的表达水平显著降低，且其靶基因SOCS1表达水平明显增高，同时炎症通路转录因子NFκB p65的胞核内表达水平显著降低，通路下游炎症因子TNF-α、IL-6分泌量显著下降，提示清化饮可能通过调控miR-155/SOCS1信号通路从而抑制炎症通路的激活及炎症因子的产生。

综上所述，清化饮可能通过调控miR-155及其靶基因SOCS1的表达从而降低胞核NFκB p65转录因子的表达水平，抑制下游炎症因子的分泌，近而减轻脾胃湿热证炎症反应而改善胃组织粘膜的损伤。这可能是清化饮临床治疗慢性胃炎脾胃湿热证的分子作用机制，研究结果将为临床治疗提供基础理论依据。

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作者简介：王薇（1975—），硕士研究生，主要从事中西医结合防治胃肠道疾病的研究。

通讯作者：胡海霞（1981—），女，医学博士，副研究员。E-mail：454090364@qq.com