长链非编码RNA GAS5通过调控miR-196b-5p抑制非小细胞肺癌细胞增殖侵袭迁移的机制

刘向前 赵天增 杨金华

(南阳医学高等专科学校第一附属医院普胸外科，河南 南阳 473000)

肺癌是全世界人类最常见的一种癌症，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占90%〔1,2〕。由于NSCLC的发病隐秘，临床上大多确诊患者已至晚期，已错过最佳治疗时期，其预后5年生存率不足16%〔3～5〕。目前靶向治疗在很多癌症中均为最有效的治疗方法，因此寻找新的NSCLC分子治疗靶标具有重要意义。长链非编码RNA(LncRNAs)是一类转录长度超过200 nt的长链非编码RNA，其在NSCLC的诊断、治疗中均具有重要作用〔6,7〕。LncRNA GAS5在NSCLC的研究中已证实为异常升高的致癌因子〔8,9〕，但其在NSCLC中具体的作用机制尚未十分清楚。miR-196b-5p在多种癌症中均出现表达异常升高〔10～12〕，包括NSCLC，但其在NSCLC中的调控机制尚未完全清楚。

本研究将以NSCLC细胞A549为研究对象，检测细胞中LncRNA GAS5和miR-196b-5p的表达，观察过表达LncRNA GAS5、抑制miR-196b-5p、过表达miR-196b-5p对NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭的影响，揭示其机制可能与miR-196b-5p靶向负调控LncRNA GAS5有关，将为NSCLC的预防和治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1材料 NSCLC细胞A549、肺支气管正常细胞16HBE购自ATCC；DMEM培养基、胎牛血清、噻唑蓝(MTT)、胰蛋白酶均购自美国GIBCO公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒购自大连Takara公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自德国罗氏公司；电化学发光(ECL)液和RIPA蛋白裂解液均购自碧云天生物技术公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；Transwell小室、基质胶购自美国Coming公司；半干转膜仪购自美国BIO-RAD公司。

1.2细胞培养 采用含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养NSCLC细胞A549、肺支气管正常细胞16HBE，置于37℃,5% CO2的培养箱中常规培养。

1.3细胞转染 将miR-196b-5p 模拟物(mimics)、miR-NC、miR-196b-5p 抑制剂(inhibitor)、anti-miR-NC、anti-miR-196b-5p、pcDNA3.1、pcDNA3.1-GAS5按照LipofectamineTM2000脂质体说明书要求转染至A549，分别标记为miR-196b-5p组、miR-NC组、miR-196b-5p inhibitor组、anti-miR-NC组、anti-miR-196b-5p组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-GAS5组；pcDNA3.1-GAS5分别与miR-NC、miR-196b-5p mimics用同样的方法共转染至A549细胞，标记为pcDNA3.1+miR-NC组、pcDNA3.1-GAS5+miR-196b-5p组，转染24 h后，用qRT-PCR检测。转染成功后，用于后续实验。

1.4qRT-PCR实验 Trizol法提取组织样本或对数生长期的细胞样本总RNA,并进行RNA定量。DNaseⅠ消化RNA中可能污染的DNA。按照逆转录试剂盒说明书要求进行操作，合成模板链cDNA。按照qRT-PCR试剂盒反应体系要求进行操作，反应结束后通过分析Ct值，计算定量结果，以2-△△Ct法计算miR-196b-5p的相对表达水平。每个样品重复3次，取平均值。

1.5Western印迹实验 RIPA蛋白裂解液对研磨组织或对数期细胞进行冰上裂解30 min。12 000 r/min离心10 min。取上清置于无菌新EP管中，加入5×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液，沸水煮沸10 min。然后离心，进行电泳，再用转膜仪将蛋白转移至PVDF膜；5% 脱脂奶粉将膜封闭2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃过夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃室温孵育2 h。加入发光液，曝光，以目的条带灰度值与β-actin灰度值的比值表示目的蛋白GAS5的表达。

1.6MTT实验 取适量1.3各组细胞，加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，培养3.5 h，然后弃去上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，震荡，使结晶溶解，在490 nm波长下检测细胞吸光度(A)。细胞的增殖与吸光值呈正比。

1.7Transwell实验 将1.3各组细胞以106个/孔接种于细胞6孔板，培养至融合度80%时，更换无血清培养基培养过夜。调整细胞密度至105个/ml，取100 μl加入上室内，600 μl含血清的培养基加入下室，培养过夜。取出小室，用棉签擦去上室内的细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min，PBS洗涤。显微镜下观察小室下表面附着的迁移细胞数，随机选5个视野计数，取平均值。将Transwell小室上表面铺适量厚度的基质胶，然后按照上述操作方法操作。最后显微镜下观察小室下表面附着的侵袭细胞。

1.8双荧光素酶报告基因检测实验 将荧光素酶报告载体(psiCHECK2-GAS5-WT，psiCHECK2-GAS5-MUT)分别与miR-196b-5p mimics、miR-NC用脂质体法转染A549细胞，培养4 h后，更换新鲜培养液继续培养，转染48 h。按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书操作步骤要求操作。结果以海参荧光素酶的发光强度与萤火虫荧光素酶发光强度的比值反映miR-196b-5p与GAS5的结合力。

1.9统计学处理 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1LncRNA GAS5和miR-196b-5p在A549细胞和16HBE细胞中的表达 A549细胞LncRNA GAS5的表达较16HBE细胞显著降低(2.11±0.26 vs 4.36±0.41，P<0.05)，miR-196b-5p表达较16HBE细胞显著升高(3.67±0.31 vs 1.06±0.16，P<0.05)。

2.2过表达GAS5对A549细胞增殖的影响 pcDNA3.1-GAS5组与pcDNA3.1组比较，GAS5表达显著升高，在48、72 h时细胞活性显著降低，均具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 过表达GAS5对A549细胞增殖的影响

2.3过表达GAS5对A549细胞迁移、侵袭的影响 pcDNA3.1-GAS5组与pcDNA3.1组比较细胞迁移及侵袭数显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 过表达GAS5对A549细胞迁移、侵袭的影响个)

2.4抑制miR-196b-5p对A549细胞增殖、迁移、侵袭的影响 如表3所示，miR-196b-5p inhibitor组与miR-NC组比较细胞中miR-196b-5p表达显著降低，在48、72 h时细胞活性显著降低，细胞迁移量显著降低，细胞侵袭量显著降低(均P<0.05)。

2.5LncRNA GAS5调控miR-196b-5p的表达 通过Target scan对可能与miR-196b-5p结合的GAS5进行预测，发现miR-196b-5p与GAS5存在互补序列(图1)。用双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光强度，与miR-NC组相比，miR-196b-5p 组WT-GAS5细胞的荧光活性显著降低，MUT-GAS5细胞的荧光活性不受影响。见表4。

表3 抑制miR-196b-5p表达对A549细胞增殖、迁移、侵袭的影响

图1 LncRNA GAS5与miR-196b-5p的靶向关系预测

表4 双荧光素酶报告实验

2.6过表达miR-196b-5p逆转了GAS5对A549细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用 如表5所示，pcDNA3.1-GAS5组与pcDNA3.1组比较miR-196b-5p表达显著降低，在48、72 h时细胞活性显著降低，细胞迁移及侵袭数显著降低；pcDNA3.1-GAS5+miR-196b-5p组与pcDNA3.1-GAS5+miR-NC组比较miR-196b-5p表达显著升高，在48、72 h时细胞活性显著升高，细胞迁移及侵袭数显著升高(P<0.05)。过表达miR-196b-5p逆转了GAS5对A549细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用。

表5 过表达miR-196b-5p逆转了过表达GAS5对A549细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用

3 讨 论

LncRNA具有组织特异性，且可以稳定存在于人的体液和组织中，这些优势使其成为肿瘤诊断的生物标志物〔13,14〕。研究证实，LncRNA在NSCLC中的表达异常升高，如X染色体失活特异性转录本基因(XIST)、低氧诱导因子1α的反义核糖核酸(HIF1A-AS1)、肺癌转移相关转录本(MALAT)1〔15,16〕。Liang等〔17〕对NSCLC患者手术前后血液中的GAS5进行检测发现，NSCLC患者血液中GAS5的表达显著降低，术后1 w患者血清中GAS5的水平显著升高，提示GAS5可作为临床诊断NSCLC的生物标志物。张学军等〔18〕在NSCLC的研究中阐明，GAS5在NSCLC中低表达，且其表达量与NSCLC的恶性程度呈正相关，预示着LncRNA GAS5有望成为NSCLC的预后标志物。Tan等〔19〕用qRT-PCR检测NSCLC组织和血液中GAS5的表达发现，NSCLC组织中GAS5明显降低，术后急剧增加，推测GAS5可用于NSCLC的早期诊断和手术治疗后的患者监测。本研究运用qRT-PCR检测了NSCLC细胞A549中GAS5的表达发现，GAS5低表达，这与前人的研究结果均相一致；又用MTT实验、Transwell实验检测了过表达GAS5的A549细胞的增殖迁移侵袭发现过表达GAS5可抑制A549细胞增殖、迁移、侵袭。

微小RNA(miRNA)被认为是基因表达的关键转录后调节因子，并且在各种癌症中作为致癌基因或肿瘤抑制因子发挥关键作用〔20〕。Li等〔21〕通过qRT-PCR、蛋白免疫印迹分析在NSCLC中检查miR-196b和GATA-6的表达，Transwell测定细胞的迁移和侵袭发现，miR-196b在NSCLC组织和细胞中均为高表达，且过表达miR-196b促进细胞迁移和侵袭，抑制miR-196b则表现出相反的效果，GATA6被证实是NSCLC细胞中miR-196b的特异性靶标，GATA6可减弱miR-196b调节的NSCLC细胞的迁移和侵袭，提示miR-196b通过下调GATA6增强NSCLC细胞的迁移和侵袭，表明miR-196b具有诊断和治疗NSCLC的潜力。Yu等〔22〕在NSCLC的研究中发现，miR-196b的表达水平异常上调，且上调miR-196b可丧失细胞与细胞的接触，刺激细胞侵袭和细胞形态变为纺锤体形状，而同源框(HOX)A9在NSCLC中的表达与miR-196b呈负相关，且HOXA9为miR-196b的靶标，HOXA9可减弱锌指2(SNAI2/SLUG)和基质金属蛋白酶(MMP)9的表达，揭示了miR-196b可以作为开发抗癌剂的潜在靶标。本研究检测了NSCLC细胞中miR-196b-5p的表达发现，miR-196b-5p在NSCLC细胞中高表达，且抑制miR-196b-5p可显著降低A549细胞的增殖、迁移、侵袭，这与前人的研究结果相吻合；深入研究，用双荧光素酶报告基因检测实验验证了miR-196b-5p靶向负调控GAS5，且过表达miR-196b-5p可逆转GAS5对A549细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用。

综上所述，GAS5可抑制NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭，其机制可能与直接负向调控miR-196b-5p有关，为NSCLC的治疗提供了新靶点。