西红花苷基于Wnt/β-catenin信号通路改善阿尔茨海默病大鼠的空间记忆

林玲 刘国良 杨丽娜 高丽

(河南医学高等专科学校 1生理学教研室，河南 郑州 451191；2预防医学教研室)

阿尔茨海默病(AD)已经成为继心血管疾病、癌症、脑卒中之后的第四大死亡杀手〔1〕，严重影响患者的生活质量，但其病因及发病机制目前并不十分清楚。研究表明，β淀粉样蛋白(Aβ)的异常沉积及老年斑(SP)的形成在AD的发病中起着非常重要的作用〔2〕。经典的Wnt/β-catenin信号通路由Wnt蛋白、Wnt受体、β-连环蛋白(β-catenin)、糖原合成激酶(GSK)-3β等蛋白构成，Wnt蛋白是重要的启动因子，β-catenin和GSK-3β蛋白是该通路的核心成分,该通路参与了多种细胞的增殖、分化和迁移，同时影响神经元轴突导向、树突发育和突触形成〔3〕。研究表明，Wnt/β-catenin信号通路可调节突触的可塑性〔4〕，与学习记忆的形成密切相关〔5〕,该通路功能紊乱与AD等神经退行性疾病的发生密切相关〔6,7〕。西红花苷对AD大鼠的空间记忆能力显著改善〔8,9〕，但其作用机制并不十分清楚。西红花苷是否可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路进而改善AD大鼠的空间记忆，目前尚未见相关报道。本实验拟通过研究西红花苷对AD模型大鼠空间记忆能力及海马CA1和CA3突触小泡蛋白(SYP)的表达和Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白表达的影响，探讨西红花苷对AD大鼠空间记忆的作用机制。

1 材料与方法

1.1动物及分组 成年雄性SD大鼠(清洁级)，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，体重180～220 g，合格证号：SCXK湘2016-0003。实验动物随机分为三组：正常对照组、AD模型组、西红花苷组，每组18只。

1.2主要药品和试剂 西红花苷标准品购自南京景竹生物科技有限公司(批号：04238-00-3)，兔多克隆抗SYP、GSK-3β、β-catenin、p-β-catenin抗体均购自Abcam公司，Aβ25～35购自Sigma公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG、Alexa Fluor ®488标记的羊抗兔IgG、兔抗GAPDH均购自碧云天生物科技有限公司(上海)。

1.3主要仪器 Morris水迷宫(北京医学科学院药物研究所)，SN-2大鼠脑立体定位仪(安徽正华科技有限公司)，微量注射泵(成都泰盟科技有限公司)，冰冻切片机(Leica公司，德国)，荧光显微镜(Olympus公司，日本)，电泳仪、转膜仪(六一仪器厂，北京)。

1.4方法

1.4.1AD模型大鼠的制备与给药 各组大鼠用8%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(10 ml/kg)，立体定位仪上依据《大鼠脑立体定位图谱》定位右侧脑室，前囟后0.8 mm,旁开1.8 mm,颅骨表面向下3.5 mm，微量注射器缓慢将5 μl Aβ25～35注射进入侧脑室构建AD模型大鼠，留针30 min 防止液体外溢，术后皮肤缝合，皮肤切开处滴加青霉素抗感染。术后次日AD+西红花苷组每天固定时间腹腔注射西红花苷(40 mg/kg)，AD模型组和正常对照组注入等量的生理盐水，连续14 d。

1.4.2Morris水迷宫实验检测各组空间记忆能力 西红花苷末次给药24 h之后进行Morris水迷宫定位航行实验和空间搜索实验。在定位航行实验中，大鼠于固定象限面向池壁入水，记录大鼠在120 s 内找到水下平台的时间即为潜伏期，训练进行5 d，每日2次，每次训练时间间隔15 min，训练期间迷宫外参照物保持不变。第6天进行空间搜索实验，记录大鼠在目标象限的停留时间和穿越原平台的次数。在定位航行实验中，AD模型组潜伏期短于正常对照组潜伏期平均值者，说明造模不成功，予以剔除，并补充造模，120 s内未找到平台的大鼠也予以剔除。

1.4.3免疫组化实验检测各组海马SYP的表达 Morris水迷宫实验结束后，各组随机选取6只大鼠，麻醉后经4%多聚甲醛心脏灌注后迅速取出脑组织,经梯度酒精脱水，石蜡包埋,冠状位切成片厚3 μm 薄片,用免疫组化(SP法)检测各组海马CA1区SYP蛋白的表达：切片经脱蜡、水洗、0.3% H2O2封闭处理，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次×5 min，经微波抗原修复后加入10%牛血清蛋白(BSA)封闭。加入抗SYP一抗(1∶1 000),4℃孵育过夜，0.01 mol/L PBS 漂洗3次×5 min，加入HRP标记的羊抗兔IgG(1∶2 000)，室温(25℃)孵育2 h,PBS漂洗3次×5 min，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜拍片，应用Image J图像分析软件测定海马CA1和CA3阳性细胞平均积分光密度。

1.4.4免疫荧光实验检测各组海马SYP的表达 各组麻醉、灌流、固定、取材步骤同1.4.3，冰冻切片机上对海马组织作连续冠状切片，厚度15 μm，切片经 0.01 mol/L PBS 漂洗3次×5 min，然后再用0.3% TritonX-100通透2 h，10% BSA封闭1 h，处理好的脑片加入兔抗SYP多克隆抗体(1∶1 000)，4℃孵育48 h;复温后0.01 mol/L PBS漂洗,暗室加入Alexa Fluor®488标记的羊抗兔IgG(1∶1 000)，室温孵育2 h，再用0.01 mol/L PBS 漂洗3次×5 min，防淬灭的封片剂封片，荧光显微镜下观察并拍照，Image J图像分析软件检测海马CA1和CA3区SYP阳性细胞平均积分光密度。

1.4.5Western印迹实验检测各组海马SYP、β-catenin、p-β-catenin、GSK3β蛋白的表达 各组最后6只大鼠麻醉后快速取出全脑,分离出海马,提取蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白定量，加5×十二烷基苯磺酸钠(SDS)上样缓冲液,100℃变性10 min。每孔加入20 μg 蛋白，Tris-SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳1 h，恒流恒压湿转法电转印到聚偏氟乙烯(PDVF)膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭1 h,分别加入兔多克隆抗大鼠SYP(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)、p-β-catenin(1∶1 000)、GSK3β(1∶1 000)抗体,4℃过夜，TBST洗膜3次×5 min。分别加入HRP标记的羊抗兔甘油二抗,室温下2 h；TBST洗膜3次,每次15 min；电光学发光(ECL)法对蛋白条带进行曝光，以GAPDH作为内参，Image J软件测定各蛋白条带的灰度值。

1.5统计学方法 采用SPSS24.0软件对所有数据进行单因素方差分析、q检验。

2 结 果

2.1各组学习记忆能力比较 Morris水迷宫实验结果显示，与正常对照组比较，AD模型组空间记忆能力明显减退：逃避潜伏期明显延长(P<0.01)；目标象限停留时间明显缩短(P<0.01)；穿越原平台的次数明显减少(P<0.01)。与AD模型组比较，西红花苷组空间记忆能力明显增强：逃避潜伏期明显缩短(P<0.01)；目标象限停留时间明显延长(P<0.01)；穿越原平台的次数明显增加(P<0.01)。见表1。

表1 各组学习记忆能力比较

2.2免疫组化实验检测各组海马SYP表达 相比于正常对照组,AD模型组SYP的表达显著减少，平均积分光密度显著减弱(P<0.01)；相比于AD模型组，西红花苷组SYP的表达显著增多，平均积分光密度显著增强(P<0.05)。见图1，表2。

表2 免疫组化实验各组大鼠海马CA1和CA3 SYP平均积分光密度(IOD)的比较

2.3免疫荧光实验检测各组海马SYP表达 相比于正常对照组，AD模型组SYP阳性细胞平均积分光密度显著减弱(P<0.01)；相比于AD模型组，西红花苷组SYP阳性细胞积分光密度显著增强(P<0.05)。见图2，表3。

2.4Western印迹检测各组海马SYP、β-catenin、p-β-catenin、GSK3β蛋白表达 相比于正常对照组，AD模型组海马SYP、β-catenin的表达均明显减少(均P<0.01)，p-β-catenin、GSK3β的表达均明显增加(均P<0.01)；与AD模型组比较,西红花苷组SYP、β-catenin的表达均明显增加(均P<0.05)，p-β-catenin、GSK3β的表达明显减少(均P<0.05)。见图3，表4。

图2 各组大鼠海马CA1和CA3区SYP的表达(DAB，×200)

表3 免疫荧光实验各组大鼠海马CA1和CA3SYP 平均积分光密度(IOD)的比较

1～3：正常对照组，AD模型组，西红花苷组

表4 各组大鼠海马SYP、β-catenin、p-β-catenin、GSK3β蛋白平均积分光密(IOD)的比较

3 讨 论

西红花，又名藏红花，是鸢尾科番红花属多年生球茎早本植物，其药用部分为其花柱的干燥柱头，具有抗动脉粥样硬化、抗氧化、降血压、抗神经元凋亡、改善学习记忆等药理作用〔10,11〕。既往研究表明，西红花苷可通过激活脑源性神经生长因子(BDNF)-TrkB信号通路，对AD大鼠学习记忆有显著改善〔12,13〕，40 mg/kg及80 mg/kg剂量对AD大鼠学习记忆的治疗作用明显优于20 mg/kg剂量组，且40 mg/kg与80 mg/kg在作用效果无显著差异〔8,9〕，故本实验选取40 mg/kg为治疗剂量，不再设置其他给药剂量。

SYP是位于突触前膜囊泡上的一种特异性钙结合蛋白，是突触可塑性的特异性标志物，与学习记忆的形成密切相关〔12,13〕。研究表明，SYP表达增加，可改善AD大鼠学习记忆能力〔14〕。本研究结果表明， 西红花苷可以通过增加AD大鼠海马CA1和CA3区SYP的表达改善AD大鼠学习记忆能力。

研究发现，在不同的AD动物模型中，均发现有Wnt/β-catenin信号通路的抑制或损伤〔15〕，而激活该通路，则可通过对神经细胞的保护作用进而对AD学习记忆能力显著改善，比如，姜黄素可通过激活该通路，增减Wnt3a和β-catenin的表达，改善AD学习记忆〔16〕,石杉碱也可以通过激活该通路抑制Aβ的沉积，进而改善AD大鼠学习记忆能力〔17〕。Aβ的聚集是AD的核心病变〔18〕，本实验中，外源性的 Aβ在大鼠脑内过多的集聚，导致细胞稳态失衡，并对Wnt/β-catenin信号通路产生明显影响，导致β-catenin磷酸化并向胞核聚集，进而抑制糖原合成激酶(GSK)3β的磷酸化。导致GSK3β的活性增加，进而引起Tau蛋白的过度磷酸化，并对神经细胞的正常功能造成严重影响。Western印迹实验表明，与正常对照组比较，AD模型组p-β-catenin和GSK3β的表达明显增加，β-catenin的表达明显减少；与AD模型组比较，西红花苷组β-catenin的表达明显增加，p-β-catenin和GSK3β的表达明显减少。分析其原因，可能是利用西红花苷进行干预治疗后，Wnt/β-catenin信号通路被激活，进而抑制β-catenin蛋白的磷酸化，GSK3β磷酸化增强，对神经元的正常生理功能进行保护，最终使AD大鼠学习记忆能力增强。

综上所述，西红花苷可以激活Wnt/β-catenin信号通路，使β-catenin的磷酸化增强，GSK3β的表达减少，增加突触可塑性分子SYP的表达，进而改善AD大鼠的空间记忆能力。