烟酰胺单核苷酸对低血糖后葡萄糖再灌注大鼠学习记忆的影响

王晓楠 徐茜 张励 杨旸 胡雪君

(中国医科大学附属第一医院老年医学科，辽宁 沈阳 110001)

低血糖是糖尿病患者胰岛素治疗的潜在并发症。重度低血糖可导致明显的神经元死亡和认知障碍〔1〕。目前临床对于重度低血糖的治疗是立即静脉输注葡萄糖以迅速升高血糖水平。但有研究发现，低血糖所致脑损害不但与低血糖本身有关，还与低血糖后葡萄糖再灌注相关，而且低血糖后葡萄糖再灌注治疗会诱导活性氧(ROS)产生增加，ROS的产生导致多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)-1活化，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/三磷酸腺苷(NAD/ATP)耗尽，导致神经细胞死亡，进一步加重低血糖性脑损害〔2,3〕。烟酰胺单核苷酸(NMN)是一种NAD+的前体物质。NMN不仅可以增加细胞内NAD+水平，还可以降低脑组织内ROS的产生〔4〕。本研究观测NMN对低血糖后葡萄糖再灌注大鼠模型认知功能的影响，并探讨其可能的保护机制。

1 材料与方法

1.1实验动物与材料 SPF级雄性SD大鼠，体重250～350 g，由中国医科大学实验动物中心提供。NMN购自美国Sigma公司；生物合成人胰岛素(诺和灵R)购自丹麦诺和诺德公司；血糖仪(拜安康)购自德国拜耳公司；2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2DCF-DA)试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.2实验方法

1.2.1动物分组及用药方法 实验大鼠以3.6%水合氯醛腹腔注射(1 ml/100 g体重)麻醉后，行颈部静脉插管术，术后观察24 h，正常饲水食。经过3 d的术后恢复，将30只反应正常的大鼠，随机分为假手术组(Sham)、低血糖后葡萄糖再灌注组(GR)、和低血糖后葡萄糖再灌注并给予NMN治疗(GR+NMN)组，每组10只。Sham组：经颈静脉泵入胰岛素(1.5 U/h)的同时泵入25%葡萄糖，使血糖水平维持在5～8 mmol/L,维持5 h。GR组：经颈静脉泵入胰岛素(1 U/h)诱导低血糖，当血糖低于1 mmol/L时，将血糖水平维持在1 mmol/L左右1 h；随后给予25%葡萄糖(2.0 ml/h)使血糖水平快速升至5～8 mmol/L，维持3 h。GR+NMN组：经颈静脉泵入胰岛素(1 U/h)诱导低血糖，当血糖低于1 mmol/L时，将血糖水平维持在1 mmol/L左右1 h；随后给予腹膜注射NMN 500 mg/kg，同时再给予25%葡萄糖(2.0 ml/h)使血糖水平快速升至5～8 mmol/L，维持3 h。造模后1 d大鼠完全清醒后，GR+NMN组给予干预治疗，每天腹膜注射NMN 500 mg/kg，Sham组及GR组腹膜注射等渗NaCl注射液(104.5 mg/kg)，连续注射1 w。

1.2.2各组大鼠学习记忆能力的检测 实验药物干预1 w后，参照参考文献对各组实验大鼠进行Morris水迷宫实验检测学习记忆能力〔5〕。其中定位航行实验历时5 d，每天4次，每次间隔20 min，主要记录实际逃避潜伏期。第5天进行空间探索实验，记录原平台象限活动时间及120 s内穿越原平台的次数。每次均3组平行进行。

1.2.3组织标本采集 各组实验大鼠在最后一次进行Morris水迷宫实验后取材。大鼠用3.6%水合氯醛腹腔注射(1 ml/100 g体重)麻醉后，断头处死，迅速取出完整海马组织，置于液氮中速冻，后移至-80℃冰箱冻存以备检测。

1.2.4海马组织内NAD+水平的测定 将冻存的海马组织置于室温下解冻，用75%乙醇-0.05 mol/L K2HPO4溶液将海马组织捣碎溶解，使NAD+在乙醇脱氢酶的作用下转换成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，13 000 r/min 14℃离心15 min,取上清液，在400～600 nm的分光光度计下测定的NADH荧光值〔5〕。

1.2.5海马组织内ROS聚集水平的测定 H2DCF-DA来检测海马组织内ROS聚集情况。将冻存的海马组织置于室温下解冻，将解冻后海马组织放置于切片机的载物台上，以400 μm厚度进行切片，并将其置于1个微孔的膜插件内，再将膜插件置于盛有H2DCF-DA(10 μmol/L)的海马组织培养液的培养皿中，37℃、5% CO2培养(培养液组成：50%MEM，25%Hank平衡盐溶液，25%无活性马血清，1%谷氨酸，6.5 mg/L D-葡萄糖，1%青霉素-链霉素)30 min后，用PBS冲洗两次，用5 mmol/L Tris HCl将海马组织切片捣碎溶解，13 000 r/min 14℃离心15 min,取上清液，在485～535 nm的分光光度计下测定DCF的荧光值〔5〕。

1.3统计学方法 采用SPSS17.0软件进行方差分析，Scheffe法。

2 结 果

2.1各组学习记忆能力比较 与Sham组比较，GR组逃避潜伏期显著延长，原平台象限活动时间显著降低，穿越平台次数显著减少(均P<0.05)。与GR组比较，GR+NMN组逃避潜伏期均显著缩短，原平台象限活动时间显著延长，穿越平台次数显著增多(均P<0.05)。见表1，表2。

表1 各组定位航行实验中每日平均逃避潜伏期

2.2海马组织内NAD+水平比较 与Sham组比较，GR组大鼠海马组织内NAD+水平显著降低(P<0.05)，而GR+NMN组NAD+水平未见明显变化(P>0.05)。与GR组比较，GR+NMN组大鼠海马组织内NAD+水平显著升高(P<0.05)。见表3。

2.3海马组织内ROS的聚集情况比较 与Sham组比较，GR组大鼠海马组织内ROS的水平显著升高(P<0.05)，而GR+NMN组大鼠海马组织内ROS的水平未见明显变化(P>0.05)。与GR组比较，GR+NMN组大鼠海马组织内ROS的水平显著降低(P<0.05)。见表3。

表2 各组空间探索试验结果

表3 各组大鼠海马组织内NAD+及ROS水平

3 讨 论

严重的低血糖会引起海马组织损伤，导致神经元死亡和认知障碍〔1，6〕。低血糖引起的神经元死亡并不是能量衰竭的直接结果，而是由多种因素共同作用的结果，其中氧化应激和多聚磷酸腺苷二核糖聚合酶(PARP)-1活化具有关键性的作用〔7,8〕。在临床中，一旦发生严重的低血糖，首选的关键治疗方法是立即补充葡萄糖快速提高血糖水平，这对于避免脑损伤是至关重要的。但研究发现，低血糖后葡萄糖再灌注可致继发性损伤，从而导致更严重的神经元死亡〔3〕。葡萄糖再灌注损伤与ROS的集聚〔3〕、炎症相关的小胶质细胞激活〔9〕及锌离子的释放〔10〕相关。虽然低血糖和葡萄糖再灌注都会导致ROS的产生，但ROS的产生主要发生在葡萄糖再灌注期间，而不是低血糖本身〔3〕。ROS的产生可诱导DNA损伤及PARP-1活化，而PARP-1活化会使NAD/ATP耗尽，最终导致神经元死亡。

NAD+是维持细胞功能和能量代谢所必需的物质。越来越多的研究证明NAD+可能在大脑的代谢过程中发挥重要作用，并对神经传递、学习和记忆等大脑的功能产生影响〔11,12〕。NMN是一种NAD+的前体物质。虽然目前尚不清楚NMN是否能通过血脑屏障，但NMN腹腔内给药可以迅速(15 min内)增加脑内海马组织和下丘脑内的NAD+水平〔13,14〕，这说明NMN可以通过血脑屏障，并诱导脑组织中NAD+的生物合成。另外NMN还可以通过直接抑制ROS的产生而发挥抗氧化应激的作用〔4〕。

本研究说明NMN有效地改善了低血糖后葡萄糖再灌注大鼠的学习记忆能力。综上所述，NMN可能通过维持海马组织内NAD+的水平及抗氧化应激的作用，来拮抗低血糖后葡萄糖再灌注诱导的脑损害，从而改善学习记忆能力。本研究为未来临床防治低血糖后葡萄糖再灌注所致的认知障碍可能提供一定的实验依据。