蜂胶小分子凝胶治疗老年大鼠口腔溃疡作用及机制

李军鸽 董雪莲 董金香 邱智东 贾艾玲

(长春中医药大学，吉林 长春 130117)

口腔溃疡是发生在口腔黏膜上的浅表溃疡，黄豆粒大小，成圆形或椭圆形黏膜损伤〔1～3〕，在中医学范畴属于“口疮”〔4,5〕，是一种口腔黏膜疾病，在临床上比较常见，中老年人口腔溃疡发病率要比青年和儿童的发病率高，且反复发病，情况比较频繁，原因之一可能与老年人机体免疫力下降，免疫细胞应答机制减弱有关〔6〕，如果不给予及时治疗，可能会导致严重口腔疾病，危及整个口腔，严重影响患者的进食和说话〔7,8〕。早在1953年就有研究者用蜂胶治疗复发性口疮，蜂胶这一天然药物对治疗口腔疾病有着独特的优势〔9,10〕。课题组结合超分子化学自组装原理以核黄素为小分子凝胶因子，制备了一种蜂胶小分子凝胶〔11〕，将其应用于老年大鼠口腔溃疡模型〔12〕，观察蜂胶小分子凝胶治疗口腔溃疡的效果，探讨其治疗机制，为治疗口腔溃疡新制剂开发提供依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及材料 清洁级Wistar大鼠(鼠龄为12个月)80只，雄性，体重280～350 g，购于吉林大学实验动物中心，SCXK(吉)2016-0005。将购买后的大鼠饲养1 w，房间温度20～25℃，相对湿度45%～65%，正常饮食，昼夜规律〔13〕。

蜂胶小分子凝胶、蜂胶提取物微粉(长春中医药大学中药药剂实验室制备)。水合氯醛(天津市光复精细化工研究所)。冰醋酸(天津新通精细化工有限公司)。蜂胶口腔膜(华润紫竹药业有限公司)。肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-2、IL-6酶联免疫吸附试验试剂盒(Ek-Bioscience)。

1.2模型的制备 将50只老年大鼠分别称重后10%水合氯醛麻醉(3 ml/kg)，取一小块脱脂棉球置于直径为3 mm的塑料管上，塑料管一端边缘与脱脂棉球对齐，然后将玻璃管和棉球端放在40%冰醋酸溶液中，待脱脂棉球被40%冰醋酸溶液浸透后，置于大鼠右颊黏膜上烧灼30 s，24 h后观察〔14～17〕。

1.3动物分组及给药 将口腔溃疡模型的老年大鼠，随机分为5组，每组10只。模型组(A组)不给药；膜剂组(B组)贴市售紫竹药业蜂胶口腔膜，每天1次，每次半贴；蜂胶提取物微粉组(C组)给予蜂胶提取物微粉，每天1次，每次1 mg；基质组(D组)给予不载蜂胶提取物微粉的小分子凝胶基质，每天1次，每次半支；蜂胶小分子凝胶组(E组)给予蜂胶小分子凝胶，每天1次，每次半支(半支蜂胶小分子凝胶中含蜂胶提取物微粉1 mg)。

给药方式为麻醉后涂抹于老年大鼠口腔溃疡面，要求均匀涂布，涂布过程均采用无菌棉签蘸取涂布，此过程不超过1 min。麻醉时间设计1 h，各组大鼠于麻醉苏醒后均可正常进食。

1.4检测指标

1.4.1测量溃疡直径，观察愈合情况 于每次给药后次日给药前用电子游标卡尺测量溃疡直径，观察溃疡愈合情况，肉眼看不见溃疡面即为愈合。

1.4.2记录体重的变化 于每次给药后次日给药前，记录每日大鼠的体重，比较治疗过程中各组大鼠的体重。

1.4.3记录治疗天数，计算溃疡愈合时间 各组大鼠持续治疗，直至溃疡完全愈合，详细记录大鼠的治疗天数，计算溃疡平均愈合时间。

1.4.4检测血清中TNF-α、IL-2和IL-6水平〔18〕变化 将30只口腔溃疡老年大鼠模型随机分为3组，模型组(A组)、膜剂组(B组)、蜂胶小分子凝胶组(E组)，每组10只，A组不给药，B组和E组给予相应的药物治疗，各组于1 d、3 d和7 d尾静脉取血5 ml，室温静置1.5 h，离心后收集血清，按试剂盒方法测定TNF-α、IL-2和IL-6含量。

1.5统计学方法 采用SPSS19.0软件和Graphpad Prism5软件进行方差分析。

2 结 果

2.1造模结果 灼烧30 s后可以看见大鼠右颊有轻微的白色损害，24 h后明显看见大鼠口腔右颊处有直径3 mm左右的椭圆或圆形的白色溃疡面〔19〕，溃疡周围红肿。

2.2各组溃疡愈合情况 治疗前、治疗后第1天和第2天各组口腔溃疡直径比较差异无统计学意义(P>0.05)，治疗后第3天，B、C、E组口腔溃疡直径与A组比较差异有统计学意义(P<0.05)，治疗后第4天B组、C组、D组、E组口腔溃疡直径与A组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组治疗不同时间口腔溃疡直径比较

2.3各组治疗前后体重变化 造模后各组大鼠体重均有明显下降趋势，各组大鼠体重与前一时间点比较差异有统计学意义(P<0.05)，A组第7天开始回升，B组、C组第4天开始回升，D组第6天开始回升，E组第3天体重开始回升。见表2。体重回升时间：E组(3 d)

表2 各组治疗不同时间体重变化

2.4各组溃疡愈合情况 B组、C组、D组、E组口腔溃疡平均愈合时间明显小于A组(P<0.05，P<0.01)，B组、C组和E组口腔溃疡平均愈合时间与D组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，B组、C组和E组口腔溃疡平均愈合时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

治疗7 d后经比较，A组愈合率为20%，D组愈合率为60%，而B组、C组与E组相同，愈合率达100%。B组和C组与E组的平均愈合时间无明显差异(P>0.05)，说明二者与蜂胶口腔膜治疗效果相当，C组和E组平均愈合时间接近，但5 d内愈合率为100%，是C组的2倍，说明蜂胶小分子凝胶治疗口腔溃疡时间更集中，需要时间更短，效果更明显。见表3。

表3 各组治疗不同时间口腔溃疡愈合情况

2.5各组血清中TNF-α、IL-2和IL-6水平比较 随给药时间的延长，A组、B组和E组TNF-α和IL-6的水平逐渐减低，IL-2的水平逐渐增高，差异有统计学意义(P<0.05)，同时B组和E组TNF-α和IL-6的水平明显低于A组，IL-2的水平明显高于A组，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表4。提示蜂胶小分子凝胶治疗老年大鼠口腔溃疡机制可能与炎症因子引起的免疫功能调节有关。

表4 各组治疗不同时间血清TNF-α、IL-2、IL-6水平比较

3 讨 论

口腔溃疡模型的制备方法有很多，其中化学灼烧法制备的老年大鼠口腔溃疡模型基本符合人类口腔溃疡模型〔20〕。目前口腔溃疡的治疗多以局部用药为主，治疗药物的种类较多，以化学药物为首，另外可用的剂型比较局限，多为散剂、膜剂、喷雾剂等，蜂胶小分子凝胶是以维生素B2为载药基质，利用超分子自组装原理，通过凝胶-溶胶法承载蜂胶提取物微粉得到的一种治疗口腔溃疡新型制剂，方法研究结果证明这种蜂胶小分子凝胶对老年大鼠口腔溃疡有显著的治疗作用，能明显缩短老年大鼠口腔溃疡愈合时间。从愈合时间来看蜂胶小分子凝胶的治疗效果与蜂胶口腔膜剂相差不多，蜂胶提取物微粉组与蜂胶小分子凝胶组比较，更能体现后者治疗过程见效快，时间短的特点，在实验过程中还发现基质组的平均愈合时间也比模型组的平均愈合时间短，可能这种以核黄素为凝胶基质的小分子凝胶对口腔溃疡有辅助促进治疗作用，这为蜂胶小分子凝胶的开发提供有利依据。对于药物治疗口腔溃疡机制研究，大多数研究结果表明，淋巴细胞和单核细胞释放的一些炎症因子参与口腔溃疡的形成，其中主要以TNF-α、IL-2和IL-6等炎症因子为主〔21～23〕，这些炎症因子可以调节机体免疫功能〔24〕，当机体发生炎症形成溃疡时TNF-α和IL-6水平大幅增加，IL-2水平降低，蜂胶小分子凝胶治疗老年大鼠口腔溃疡机制可能与炎症因子引起的免疫功能调节有关，通过抑制TNF-α和IL-6等因子和增强IL-2等因子促使口腔溃疡愈合。