福建省2012-2018年布鲁氏菌分离株的MLST分型

陈志平，韩腾伟，林代华，周淑姮，刘维俊，刘 菁，肖方震，邓艳琴

布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌属细菌引起的能造成机体全身性感染的人兽共患病。人感染后通常表现为发热、盗汗、乏力以及关节疼痛等症状，临床体征缺乏特异性[1]，转化为慢性疾病后可反复发作、长期不愈[2]；动物感染后则常导致流产和不孕，严重影响人群健康与畜牧业经济发展。近年来，我国布病发病率居高不下，发病数逐年递增，全国范围内报告布病病例从2005年的18 个省份发展到2016年的31 个省份，其中大部分病例聚集于北方省份如内蒙古、山西以及黑龙江等，南方地区主要为散发病例但也呈现递增状态[3]，形势较为严峻。对布鲁氏菌的分子流行病学研究有助于布病疫区性质的鉴定，也有助于布病疫情的控制。本研究收集了福建省各设区市43 株布鲁氏菌菌株，以MLST方法为手段探索其种群结构及遗传进化关系。

1 材料与方法

1.1布鲁氏菌菌株 43株布鲁氏菌菌株分离自2012-2018年福建省各设区市布病病例，由福建省疾病预防控制中心收集或分离、鉴定与保存。

1.2实验仪器与试剂 实验仪器主要有电泳仪、电泳槽、CO2培养箱、冷冻高速离心机、梯度PCR仪、生物安全柜、凝胶成像仪等；试剂主要有布鲁氏菌培养基(BD)、单相特异性血清A/M、硫堇/碱性复红染料、PrimeSTAR Max DNA聚合酶、细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN)、DL2000 DNA Marker等，引物由生工生物工程股份有限公司合成。

1.3传统细菌学鉴定 根据菌落形态、染色、生长特性和布鲁氏菌诊断血清凝集试验对上述43株布鲁氏菌进行复核鉴定；利用单相特异性血清凝集试验(A/M)、H2S产生试验、CO2需求、双层琼脂法噬菌体裂解试验、染料抑菌试验(硫堇/碱性复红)等进行种型鉴定，具体操作参照《布鲁氏菌病防治手册》[4]进行。

1.4MLST引物 本研究选用布鲁氏菌7 个管家基因(aroA、cobQ、dnaK、gap、glk、gyrB、trpE)、1 个基因间区(int-hyp)和1 个外膜蛋白基因(omp25)的序列进行改良MLST分型研究，选取目标基因片段较传统MLST分型研究增长约100～200 bp，部分引物参照文献[5]合成，其余引物通过Primer Premier 5.0软件设计合成，引物信息见表1。

表1 MLST靶标基因、引物序列与扩增产物长度

1.5菌株DNA提取 将菌株转种于布鲁氏菌琼脂斜面培养基，37 ℃培养至对数生长期，取适量菌体于300 μL灭菌去离子水中，80 ℃ 2 h灭活，经DNA提取试剂盒提取布鲁氏菌DNA，按说明书操作，-20 ℃保存。

1.6PCR扩增及产物测序 PCR扩增采用50 μL反应体系：2X PrimeSTAR Max Premix 25 μL，ddH2O 14 μL，引物(10 μmol/L)5 μL，模板1 μL。aroA、cobQ、dnaK、gap、gyrB、trpE、int-hyp7个基因PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，63 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃延伸5 min。glk、omp25两个基因PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，获得特异性目标条带后送生工生物工程股份有限公司测序。

1.7序列分析 整理测序结果，采用MLST在线分析工具(https://pubmlst.org/brucella/)对其进行等位基因型与ST型的确定。通过Bionumerics 6.6软件进行聚类分析及绘制最小生成树(MST)。

2 结 果

2.1菌株分布 43株布鲁氏菌分离株来源于福建省各设区市，分布情况为：福州4例，龙岩10例，南平6例，宁德2例，泉州3例，三明4例，厦门4例，漳州10例。其中，2012年4株，2013年8株，2014年5株，2015年8株，2016年6株，2017年5株，2018年7株。

2.2传统生物学鉴定与ST型鉴定 43株布鲁氏菌分离株中，传统生物学鉴定显示38株为羊种3型，5株为猪种3型；ST型鉴定显示38株为ST8型，5株为ST17型。详见表2。

表2 43株布鲁氏菌菌株MLST分型与细菌学分型结果

2.3菌株聚类分析 通过Bionumeric 6.6软件使用UPGMA方法，对福建省43 株布鲁氏菌分离株的9 个位点、不同ST型、不同生物型以及菌株相关信息进行树状图聚类分析，绘制系统树图(图1)。图中显示，5 株猪种3型菌株聚集成一簇，均为ST17型，来自于漳州地区；另38 株均为羊种3型菌株，均为ST8型，分布于福建省各设区市。选取国内已发表文献[5-6]中的192 株布鲁氏菌分离株(羊种菌111 株，牛种菌52 株，猪种菌15 株，犬种菌14 株)MLST分型结果，与福建省分离株共同进行聚类分析，通过Bionumeric 6.6软件进行MST图的绘制(图2)，根据分类系数确定不同菌株之间的最小进化路径[7]，结果显示福建省与青海省、宁夏省、安徽省以及北京市共享ST8型，与吉林省、湖南省共享ST17型。ST7与ST8型之间遗传距离较近，ST14与ST17型之间遗传距离较近，ST7型与ST14型来源于青海省。

图1 福建省43株布鲁氏菌菌株MLST聚类分析系统树图

(图中数字代表MLST基因型)

3 讨 论

病原体常通过不同的分型方法进行鉴定。在布鲁氏菌分型研究中，如传统细菌学分型、脂肪酸分型与基因分型等方法均有应用[8-9]。传统细菌学分型主要根据布鲁氏菌的生化特性，并结合主要宿主的不同对其进行鉴定，其产生的数据很难在实验室之间进行比较而且通常不适合进行进化、系统发育或种群遗传学研究，而多位点序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)可以有效的解决这一问题[10]。MLST主要是通过管家基因内部片段的核苷酸序列来对分离的细菌和真菌进行鉴定的一种方法[11]，其产生准确的可传输的序列数据并且通过统一的标准进行数据比较[12]，具有简便、可比性强、可靠性高等特点而被广泛应用，并且，omp25、virB5以及virB8等对毒力相关基因的多位点分析[13]，在了解病原微生物毒力系统发育方面也具有重要意义[14]。

目前研究中较常采用的MLST分型方法主要包括两种：改良MLST分型研究(EMLST)与传统MLST分型研究(CMLST)，EMLST相对于CMLST扩增更长的目标基因片段，获得的有效序列长度显著增加，陈燕芬等[5]曾对同一批菌株进行ST型鉴定比较这两种方法时发现，EMLST相比于CMLST鉴定的各基因等位基因型与ST型型别更多，分辨率更高，因此本研究亦采用EMLST方法对布鲁氏菌分离株进行分型研究，以期鉴别发现更多不同的布鲁氏菌ST型，探索福建省布鲁氏菌分离株种群结构与遗传进化关系。

本研究的43 株布鲁氏菌分离株中，38 株为羊种布鲁氏菌，5 株为猪种布鲁氏菌，表明福建省布病优势菌种为羊种布鲁氏菌，与全国范围内的分布趋势相符[3]。38 株羊种布鲁氏菌菌株分布于各设区市地区，提示不同城市之间可能存在着牲畜交易流动；5 株猪种布鲁氏菌菌株均来自于漳州，可能是与该地区近几年从事猪类养殖、屠宰加工的高危职业人群迅速增加，以及周边地区牲畜交易、流动频繁等因素有关[15]。

MLST分型发现，福建省布鲁氏菌种群结构由ST8与ST17型构成，主要型别为ST8型，占菌株总数的88.4%，故福建省主要流行菌株为ST8型。MLST分型结果与传统细菌学分型结果比较发现，相同生物型布鲁氏菌可以分成不同的ST型，说明MLST分型的分辨率高于细菌学分型，但两者之间并无明显的关联性，可能是因为传统分型方法主要受实验人员主观判断以及诊断试剂非标准化等因素影响，使得两者之间的真实联系被掩盖[16]。

在布病疫情暴发关联研究以及追溯传染源方面，MLVA与MLST均为非常实用和重要的分子流行病学调查工具，且具有不涉及活菌、操作简便迅速、费用较低、重复性较好等特点。韩腾伟等[15]曾对福建省布鲁氏菌分离株进行MLVA分型研究发现，40 株布鲁氏菌可分为32 个型，相比于MLST分型分辨率更高，但MLST选取管家基因进行分型，相比于MLVA更适合于进化关系与种群结构的研究[17]，二者均能够将经典的生物种区分开来。

本研究整合国内已报道的192 株布鲁氏菌MLST分型结果同福建省分离株进行聚类分析，MST图显示福建省布鲁氏菌菌株与其他省份、地区菌株存在着高度同源性，如与青海、宁夏等省份共享ST8型，与吉林省、湖南省共享ST17型，另外，ST7型与ST8型聚集为一簇，两者间存在3 个位点的变异，表明这2 种基因型关系较为接近；ST14型与ST17型聚集成一簇，两者间存在着2 个位点的变异，关系最为接近。上述不同省份地区菌株与福建省菌株均出现了基因型相同或相似的情况，一方面表明了福建省与其他省份地区之间可能存在着牲畜及其相关制品流通；另一方面也提示我们需加强不同省份地区之间牲畜及其相关制品流通的检疫监管力度[15]。

多位点序列分型技术是适合于分子流行病学调查与遗传进化关系研究的一种方法手段，本研究收集福建省近7年的43 株布鲁氏菌分离株进行MLST分型研究，初步反映了福建省布鲁氏菌菌株的种群结构及遗传多态性，但由于菌株量较少且包含的细菌种属并不全面，使得福建省布鲁氏菌属细菌的遗传进化关系并不够明了，但在一定程度上也丰富了中国南方地区的布鲁氏菌MLST数据库。在今后的研究中，将继续收集布鲁氏菌分离株，以获得更大量的样本，使得分析结果更具有代表性。

利益冲突：无