灵芝多糖的提取方法及药理活性研究进展

于海洋 王延锋* 万 里 史 磊 王金贺 盛春鸽 刘姿彤 张 鹏

（1. 黑龙江省农业科学院牡丹江分院，黑龙江 牡丹江 157041；2. 牡丹江康安医院，黑龙江 牡丹江 157041）

灵芝（Ganoderma lucidum）又称灵芝草、长生草、仙草等，在我国已经有2 000多年的药用历史，东汉《神农本草经》、东晋《抱朴子·仙药》、明朝《本草纲目》和《中华人民共和国药典》（2000版）中均有收录记载。灵芝具有扶正固本、强身益气、安心宁神等药用功效[1]。灵芝多糖（G. lucidumpolysaccharides，GLP）是一类活性较强、功能较全的天然糖类高分子化合物，由多个单糖分子缩合而成。构成灵芝多糖的单糖及其衍生物多达十几种，主要有葡萄糖、肽多糖、D-木糖、D-甘露糖等，其形成的糖苷键复杂，且合成不遵循遗传中心法则[2]。提取自灵芝的多糖组分通常分为α型和β型。研究表明，灵芝多糖具有降血糖，抑制肿瘤，抗氧化，免疫调节，降血脂等功能，发挥功能的通常是具有β构型的有效多糖。目前，灵芝多糖在医疗、保健、化妆品等领域应用十分广泛[3-4]。

1 灵芝多糖的提取分离

1.1 多糖的提取方法

灵芝多糖存在于灵芝的子实体、菌丝体、液体发酵培养液和孢子粉中。传统提取方法有热水提取法[5]、酶法提取[6]、超临界流体辅助提取[7]、超滤法[8]、微波辅助提取法[9]、超声波提取法[10]和超声-微波协同萃取法等[11]。

灵芝子实体中的多糖通常采用热水浸提法提取，操作相对简单：将子实体粉碎后，利用多糖溶于热水而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂的特点，直接浸提。但多糖得率不高，且多数为胞外多糖。此外，超声波提取法应用也较多，其机理是利用超声波辐射产生空化作用、热学作用达到物理破碎，多糖随着细胞壁的破碎而释放出来，提取时间比传统的热水浸提法缩短3/4，多糖得率也有所提高[12]。酶法提取多糖主要利用纤维素酶降解细胞壁上的纤维素、蛋白质等，使多糖容易被提取，条件相对温和，工艺较简单，易操作。而采用多种提取方法联合提取，可有效增加灵芝多糖的提取率和得率。

灵芝菌丝体中的多糖通常提取自无菌条件下液体发酵所得的灵芝菌丝体，相对于子实体提取，菌丝体提取多糖周期短，效益高，不受季节条件限制，更适用于工业化生产。无论采用传统的热水浸提法还是超声波提取技术等，多糖提取率和得率菌丝体都高于子实体，这是由于液体培养的菌丝体细胞壁疏松、脆弱，相对于木质化的子实体，多糖更容易提取出来[13]。液体发酵菌丝体提取多糖相对稳定，不受外界因素影响，因此是多糖提取的一个重要趋势。此外，液体发酵所得的发酵液中也含有部分多糖，但由于培养基中的碳源也提供了部分多糖，所以成分相对复杂，增加了提取的难度。

1.2 多糖的纯化

灵芝多糖的粗提物中通常混杂一些蛋白质、色素、低聚糖等杂质成分，因此需要进一步的分离纯化。分离纯化一般分为除蛋白质、脱色素、脱盐、去小分子杂质等初级纯化，以及离子交换色谱、凝胶过滤、凝胶电泳法等精细纯化，目的是将粗多糖纯化为基本无蛋白质及其他小分子杂质的多糖。

多糖的初级纯化中，相对温和的Sevag法较常用于去除蛋白质，将氯仿、正丁醇、多糖溶液按比例混合反复萃取直至蛋白质去除，对多糖本身的影响较小[14]。三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法等脱蛋白方式相对剧烈，会损失部分多糖，且三氟三氯乙烷易挥发、有毒性，三氯乙酸为中强酸，对后续多糖的分离纯化有一定的影响[15]。木瓜蛋白酶法可以在较低的温度下将蛋白质分解成氨基酸或多肽等小分子物质使其沉淀，但后续仍需要进行脱色处理。

灵芝多糖一般含酚类化合物，导致颜色较深，可采用氧化法、吸附法、离子交换法、金属络合物法等进行脱色处理。氧化法和吸附法常温下可进行，但由于活性炭的吸附能力较强，会导致多糖得率下降，过氧化氢只是将色素氧化，目前利用弱碱性的DEAE纤维素进行脱色处理较为常见[16]。多糖中的盐或其他小分子物质主要通过不同分子量的透析袋（膜）去除，通常采用SephadexG-25离子交换柱法，此法相对操作简单，对多糖的结构、功能影响较小。Jiang等[17]利用A103S阴离子交换树脂填充洗脱，色素、杂质等去除率达到80%以上，且快速、高效，多糖损失率低。

多糖含量的测定，主要利用多糖与试剂呈颜色反应，测定的吸收度与含量呈线性关系的原理。蒽酮-硫酸法利用糖与浓硫酸反应生成糠醛或羟甲基糠醛，测定多糖含量较为常用；苯酚-硫酸法测定多糖含量灵敏度高，稳定且不需要水解，可用于测定固体多糖的含量[18]。此外，还可采用3,5-二硝基水杨酸法等对多糖进行测定。

2 灵芝多糖的药理活性

2.1 抗氧化作用

机体在代谢过程中产生的大量自由基，会加速机体的老化。研究表明，灵芝菌丝体水溶性多糖、发酵液多糖、菌丝体碱提多糖都可以不同程度地防止脂质过氧化，降低羟基自由基、ABTS自由基、DPPH自由基的产生，减少红细胞溶血，清除巨噬细胞中叔丁基过氧化物产生的自由基，提升H2O2的代谢能力，多糖与灵芝其他活性物质协同作用，其抗氧化能力不亚于抗氧化剂BHA（butylated hydroxyanisole）[19-20]。灵芝多糖能够促进体内白介素的合成，加快细胞的增殖分裂，可以调节Enos活性和NO的产生，对血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）干预的人脐静脉血管内皮细胞的衰老有抑制作用[21]，能够降低血清和心肌匀浆的丙二醛的水平，降低超氧化物歧化酶含量，间接清除氧自由基或提高GSHpx水平[22]。灵芝多糖还能阻止四氧嘧啶诱导的胰岛损伤[23]。

2.2 抗病毒作用

灵芝胞内多糖对流感病毒有一定的抑制作用[24]。灵芝蛋白多糖通过抑制过滤性病原体的复制，干扰病毒早期进入目标细胞后的吸附，而达到抗病毒效用[25]。虾的体液中含有氧化酶原激活系统等免疫因子，但不具有免疫球蛋白，灵芝多糖可以激活虾类的非特异性免疫系统，从而达到预防细菌和抗病毒的作用[26]。

2.3 抗肿瘤作用

灵芝多糖通过对肿瘤细胞产生毒副作用，诱导细胞凋亡从而直接抑制肿瘤细胞生长；并通过增强机体免疫力影响T细胞、B细胞和补体系统等，达到间接对抗肿瘤的效果[27]。灵芝多糖间接提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，从而提高对肿瘤细胞的杀伤活性[28]，如灵芝多糖可提高小鼠免疫功能，有效抑制H22肝腹水瘤细胞的增殖[29]。

林志彬[30]认为灵芝多糖能够促进树突细胞的成熟分化，起到促进淋巴细胞活化抑制肿瘤细胞生长的作用。Wasser[31]认为灵芝多糖的抗肿瘤活性在以β（1→3）为糖苷键主链、β（1→6）为糖苷键支链时，相对于只有以β（1→6）为糖苷键为主链时，所发挥的作用更加明显。可见，灵芝多糖的抗肿瘤活性与其化学组成及物理性状存在相关性[32]。灵芝多糖还具有阻止肿瘤增大及防止癌细胞扩散的功能，甚至能将癌症细胞反转成正常细胞[33]，对于癌症治疗研究有重大意义。

2.4 降血糖作用

据统计，糖尿病病例正以每年6%的速度上涨，而高血糖是造成糖尿病的主要原因之一。灵芝多糖能够通过刺激胰岛分泌胰岛素，对四氧嘧啶及去甲肾上腺素所导致的血糖升高的小鼠具有明显降血糖效果，而对血糖正常的小鼠却没有继续降低的作用。可见，灵芝多糖对血糖具有双向调节的作用[34-35]。

实验证明，从赤芝子实体中提取的多糖能够促使外周组织充分利用游离的葡萄糖，降低高血糖的发病率；灵芝多糖能够抑制肝脏PEPCK的表达，Ⅱ型糖尿病患者每天服用一定量的灵芝多糖，能够降低空腹血糖水平[36]。

2.5 免疫调节作用

大多数灵芝多糖在机体内都能够起到免疫调节的作用。Li等[37]用提取自灵芝液体培养液的一种富含半乳糖胞外多糖（GLP-2），对体重为20±2 g的三个月大昆明雄性小鼠进行注射，当注射剂量为75 mg/kg时，便可提高T淋巴细胞和B淋巴细胞的存活率，并产生抗体；当注射剂量达到150和300 mg/kg时，对T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，抗体的形成，脾脏组织数量及免疫功能都有显著的促进作用。灵芝水溶性复合多糖对人体免疫细胞NK-92MI具有刺激分泌IL-2和I-309免疫因子的作用，能够增加人体脾单核细胞表面的Dectin-1表达，从而提高免疫力[38]。

灵芝多糖对黏膜免疫具有一定的促进作用，能够刺激肠道黏膜和上皮淋巴细胞增殖，同时能激活TNF-α和IL-10mRNA的表达，通过增殖淋巴细胞激活全身的免疫系统，达到提高免疫力的作用[39]。

2.6 其他作用

灵芝多糖可以修复因CCL4中毒引起的小鼠肝损伤，其原理是多糖中的D6对小鼠血清ALT和肝脏TG含量的升高起拮抗作用，增加小鼠的耐毒性，并减少DL-乙硫氨酸引起的肝脏脂肪堆积，提高肝脏代谢戊巴比妥钠的能力，促进肝脏再生[40]。

灵芝多糖还具有明显的镇痛、镇静、抗惊厥作用，小鼠长期给服一定剂量的灵芝多糖，能够延长巴比妥类药物的中枢抑制作用时间，使小鼠耐受电击的能力增强；灵芝多糖能够通过增强心肌氧和能量的供给，增强心肌收缩力，改善心肌缺氧状态，缓解因心肌缺血所导致的身体不良症状；长期服用灵芝水能止咳化痰，并对呼吸道疾病有显著疗效[41]。虽然灵芝多糖的结构和分子构象尚不十分明确，但灵芝多糖还被证实具有抗炎、抗微生物、抗凝血、促进红细胞免疫、促进吞噬细胞增殖等功能[42-43]。

3 小 结

近年来，随着养生保健观念的日益深入人心，国内对灵芝功能性成分的探索和利用已成为现代医疗保健研究的主要方向之一。灵芝多糖作为重要的生物活性物质，除了具有降血糖、抗肿瘤、免疫调节、抗病毒等生理功能之外，还具有调节肝脏功能及改善睡眠等功效。随着人工栽培灵芝技术的完善和普及，灵芝价格逐渐降低，灵芝多糖将不仅仅应用于药品、保健食品、化妆品等领域，也将在临床医疗、畜禽免疫、新型免疫增强剂、预防病原体的感染等领域得到广泛应用。目前，对于灵芝多糖的研究大多停留在提取和功能鉴定的层面，相信在不久的将来，随着研究的不断深入，对其的开发利用必将上升到新的高度。