m6A甲基化修饰在肝癌中的研究进展

金 松,朱小年,谭盛葵

金松,朱小年,谭盛葵,桂林医学院 广西壮族自治区桂林市 541100

0 引言

表观遗传学在癌症的发生发展过程中起到了非常重要的作用,其包括DNA甲基化、组蛋白修饰和RNA修饰等.到目前为止,已经鉴定出超过170种RNA修饰,包括RNA甲基化、伪尿苷化(pseudouridineψ)、N1-甲基腺苷(N1-methyl-Adenosine,M1A)等[1].N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)甲基化是RNA修饰中最广泛最重要的化学修饰之一,最初于1974年在mRNA中被发现[2],其广泛存在于真核生物的mRNA和长链非编码RNA(long non-codingRNA,lncRNA)中.m6A甲基化在RNA修饰中非常普遍,参与了RNA基本的病理生理代谢过程,包括剪接、核输出、翻译和衰变等[3].

m6A甲基化是指将甲基转移到核酸中腺苷的N-6位置[4],它是在1974年纯化的poly(A)RNA片段中发现的,它是真核细胞中最普遍、最丰富的修饰之一,几乎存在于所有真核生物中[5].m6A甲基化主要出现在RRm6ACH的共识序列中([G/A/U][G>A] m6AC[U>A>C]),并富集于转录起始区、编码序列(Coding sequence,CDS)和3'-非翻译区(3'-UTR)[6].m6A修饰是一个动态的可逆的生物过程,受甲基转移酶(也称为m6A writers)和去甲基化酶(也称为m6A erasers)的调控,另外还有识别m6A修饰的结合蛋白(也称为m6A readers)的参与.

本文通过m6A甲基化修饰的相关调节蛋白阐述m6A甲基化在肝癌中的作用及其机制,旨在为肝癌的早期诊断、治疗和预后提供研究方向和线索,讨论m6A成为肝癌治疗和预后新靶点的可行性,为后续关于m6A甲基化研究提供思路.

1 m6A甲基化的调控因子

1.1 m6A writers m6A甲基转移酶是调控m6A甲基化修饰的重要酶类,由多种m6A甲基转移酶复合物组成,包括甲基转移酶3(methyltransferase-like 3,METTL3)、甲基转移酶14(methyltransferase-like 14,METTL14)、Wilm1肿瘤结合蛋白(wilms tumor 1-associating protein,WTAP)等[7].其中METTL3是可以将甲基从S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)转移至受体腺嘌呤部分的催化亚基,METTL14作为一种伪甲基转移酶来支持METTL3并识别目的RNA,而WTAP具有确保METTL3-METTL14异源二聚体的定位并促进其催化活性的功能[7].还有一些其他的调控蛋白包括RNA调控结合蛋白15(wilms tumor 1-associating protein,RBM15)、类病毒m6A相关甲基转移酶(vir-like m6A methyltransferase associated,VIRMA)等也起到甲基转移酶的作用[8].

METTL3是最早被鉴定出来的甲基转移酶,1997年Bokar等人[9]首次从Hela细胞中分离出METTL3,发现其可以作为m6A“writers”具有催化mRNA和非编码RNA的功能.它可以催化甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移到受体腺嘌呤上[10].METTL3在肝癌[11]、乳腺癌[4,12]、胃癌[7]等多种癌症细胞中高表达,具有促进癌细胞侵袭和转移的作用.也有研究表明METTL3有抑癌作用,过表达METTL3可抑制胶质母细胞瘤干细胞的生长、自我更新和肿瘤发生[13].METTL3是研究较多的甲基转移酶,但它的功能和作用机制尚未完全明了,还需进一步的探索.

METTL14对细胞的增殖分化具有双向作用,Sun[14]等人在他们的研究中发现:METTL14可以参与lncRNA-942的m6A修饰,分别增强细胞色素P450家族1B1(cytochrome P450,family1,subfamily b,polypeptide1,CYP1B1)和趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)的表达和稳定性,从而促进细胞增殖和集落形成,抑制细胞凋亡.然而,还有类似研究表明[12],METTL14的过表达抑制乳腺癌细胞生长和集落形成.另外METTL3和METTL14可以形成稳定不对称的METTL3-METTL14复合物并与WTAP结合,发挥甲基化功能[10].METTL14的下调还与肿瘤的恶化及患者预后较差及生存期较短密切相关[15,16].提示METTL14在预测肿瘤转移和复发方面具有潜在的作用.

WTAP并没有催化甲基化结构域和甲基化酶的活性,但它是甲基转移酶复合体的组成部分,能将METTL3-METTL14异二聚体定位于核斑点并激活甲基转移酶复合物从而促进m6A甲基化修饰[5].有大量研究表明WTAP在多种肿瘤中过表达,并与患者预后不良有关.WTAP和m6A在胃癌组织和细胞中的表达均上调,WTAP的过表达与胃癌患者预后不良密切相关[17].

此外,陆续发现的甲基转移酶如METTL16、METTL5和锌指CCHC-4 (ZCCHC4)也是m6A甲基转移酶,可直接催化RNA分子中的m6A修饰[18].

1.2 m6A erasers m6A修饰是一个动态可逆的过程[5],需要去甲基化酶参与去甲基化过程.主要的去甲基化酶有脂肪量和肥胖相关基因(fat mass and obesity associated gene,FTO)和AlkB同源蛋白5(alkylation repair homolog protein 5,ALKBH5),FTO可以通过调节m6A修饰影响mRNA的稳定性和翻译效率[5],ALKBH5则通过氧化性逆转m6A来影响mRNA的输出、代谢和mRNA加工因子在核斑中的组装[19].两者均在肿瘤的发生和发展具有双向调节作用.

FTO是第一个被发现的m6A去甲基化酶.在生理条件下,m6A是目前发现的FTO去甲基化作用的最佳底物[20].FTO的作用与m6A的位置有关:在细胞核中,FTO对核小RNA(small nuclearRNA,snRNA)中的m6A和m6Am至关重要;而在细胞质中,FTO对poly-A RNA中的m6Am帽至关重要[21].Li[22]在研究中发现FTO在肝细胞癌中表达上调.此外,FTO沉默时HCC细胞中m6A水平升高,且在小鼠体内敲除FTO可以抑制肿瘤的生长.

ALKBH5是另一种去甲基化酶,存在于细胞核中,过表达ALKBH5的细胞中mRNA的m6A水平显著降低.ALKBH5可以影响mRNA的输出和装配过程[19].ALKBH5通过催化NANOG mRNA 3'-UTR腺苷残基的去甲基化,促进乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSC)在肿瘤微环境中的生长和富集[23].另外,ALKBH5降低了lncRNA核旁斑组装转录本1的水平,lncRNA核旁斑组装转录本1在胃癌细胞和组织中过表达,在胃癌的侵袭和转移过程中发挥了重要作用[24].

1.3 m6A readers m6A的阅读蛋白指的是一类含有YTH结构域的蛋白的总称,主要包括YTH-N6甲基腺烯苷RNA结合蛋白(YTH N6-methyladenosine RNA-binding protein 1/2/3,YTHDF1/2/3)、YT512-同源结构域蛋白(YT512-B homology domain-containing protein,YTHDC1/2)等.除了YTH结构域家族,其他阅读器如核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,HNRNP)家族、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(insulin-like growth factor2 binding proteins,IGF2BPs,包括IGF2BP1/2/3)和真核翻译起始因子3(eukaryotic translation initiation factor3,eIF3)已经被发现[18,25].与阅读器蛋白结合的经m6A修饰的mRNA,其亲和力比未修饰的mRNA增强10-50倍,可编码m6A修饰信息,发挥翻译等功能.最近的研究发现,FMR1和LRPPRC也可以作为m6A的阅读器参与m6A的修饰[26].

YTHDF1在肝癌中强烈表达,与患者预后不良密切相关.YTHDF1调控的下游分子参与细胞周期、氨基酸降解和脂质代谢[27].Zhong等[28]人的研究显示YTHDF2在肝癌中可能发挥抑癌作用,因为过表达YTHDF2可抑制肝癌细胞的增殖,促进细胞凋亡.且YTHDF2的表达与患者生存期呈负相关.因此,YTHDF2在肝癌中具有致癌作用,可能会成为检测肝癌的一个有用的生物标志物[29].

YTHDC1调控RNA的剪接,其YTH域特异性识别m6A修饰,优先识别G(m6A)C序列[30].YTHDC2调控m6A分子的稳定性,并促进RNA降解机制的形成,它还可以利用其独特的RNA结构在m6A mRNA和核糖体之间建立桥梁,促进其有效翻译[31].YTH家族的很多功能和机制尚未十分清楚,还需做进一步的研究.

2 m6A在肝癌中的作用及其机制

m6A调控因子在肝癌中是失调的,近年来m6A在肝癌中的作用及其机制陆续被阐述.“m6A writers”“m6A erasers”和“m6A readers”在肝癌的发生发展过程中起到各自的作用.多个研究发现[32-34],METTL3在人肝癌中具有致癌功能,在原位异种肝移植模型中,敲低METTL3可降低肝癌的发生和肺转移.从机制上讲,METTL3促进肿瘤抑制细胞因子信号转导抑制因子2(suppressor of cytokine signaling2,SOCS2)mRNA 3'端的m6A修饰,从而通过依赖YTHDF2的途径促进SOCS2 mRNA降解[32].另外METTL3的缺失在体内外均可下调m6A,降低癌细胞的迁移、侵袭和上皮-间质转化(EMT)的能力,m6A可以调控EMT的进展和Snail(EMT过程中关键的转录抑制因子)的表达[33].此外,降低METTL3表达可以抑制mTORC1活性,促进肝癌细胞的糖酵解.无论是在单独治疗还是与抗代谢物联合治疗上,METTL3都是HCC的理想治疗靶点[35].临床资料显示肝癌组织中METTL3和YTHDF1的含量高于邻近正常组织,并且与肝癌患者生存期较短和预后不良有关[36].

有大量研究表明METTL14可以发挥抑制癌症的功能.METTL14在肝癌细胞的表达降低,并且与肝癌的复发相关,已经证实METTL14过表达可显著增加m6A修饰的pri-miR-126数量;从机制上讲,METTL14可以以微处理器蛋白DGCR8依赖的方式正向调节pri-miR126,miR-126反过来又可通过下调METTL14的表达抑制肿瘤的转移[16];METTL14的下调可以降低m6A水平和miR-126的表达,从而促进肝癌的转移[37].在另一项研究中,METTL14被发现通过促进miR-375 m6A依赖的成熟而抑制结直肠癌进展,这不仅可以通过靶向Yes相关蛋白1(YAP1)抑制癌细胞增殖,还可以通过miR-375/SP1通路抑制癌细胞的迁移和侵袭[15].

KIAA1429(VIRMA,vir-Like m6A相关甲基转移酶)也在m6A修饰中起到关键的作用,KIAA1429在HCC组织中的表达明显高于癌旁组织,且KIAA1429表达升高的HCC患者总生存期和无病生存期较差.GATA3(GATA相关蛋白3)是KIAA1429介导的m6A修饰的直接下游靶点,沉默GATA3可以逆转KIAA1429抑制的细胞增殖和转移[38].

m6A甲基化是一个可逆的过程,m6A去甲基化酶与肝癌的发生和发展也有着密切的联系.有研究表明FTO在HCC组织和细胞中均表达上调.此外,敲除FTO时HCC细胞中m6A水平升高并抑制肝癌的增殖,其机制可能是FTO可以降低PKM2(丙酮酸激酶)mRNA的甲基化,从而上调PKM2的表达,是肝癌预后不良和生存期较短的原因之一,并为肝癌的治疗提供潜在靶点[22].敲除FTO诱导细胞周期阻滞,抑制肝癌细胞集落形成能力,并伴随整体m6A水平的升高[11].然而也有研究显示FTO在肝癌发展过程中起保护作用,肝细胞特异性FTO缺失可以影响肝癌起始期,还抑制Cul4a的翻译而影响肝癌发展[39].另外在肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)中发现了FTO蛋白水平的下调,且在ICC中FTO的丢失与癌症的侵袭性和不良预后相关;在功能上,敲除FTO可减少ICC细胞的凋亡[37].FTO在肝细胞癌和肝内胆管癌中呈现相反功能,还需做进一步的探索.ALKBH5在肝癌中的表达也是下调的,并与肝癌患者预后不良相关,其机制可能是ALKBH5可介导的m6A修饰被IGFBP1识别,使得LY6/PLAUR结构域1(LYPD1)转录后失活(LYPD1是已被确认的肝癌致癌因子)并促进肝癌的发生[37].

除了甲基化酶和去甲基化酶,m6A阅读蛋白也被证明与肝癌的发生有关.YTHDF1在肝癌中表达上调,且与肝癌患者术后总生存期较短相关.YTHDF1是一个参与调节肝癌细胞周期和代谢的独立不良预后因子,被认为是一种促癌因素[31].虽然YTHDF2被称为m6A解读器,但研究表明YTHDF2可以影响细胞中m6A甲基化水平,Yang等人[40]发现miR-145是YTHDF2的转录后调节因子.miR-145与YTHDF2 mRNA的3’UTR结合,显著抑制其表达,而miR-145在肝癌中经常下调,并与YTHDF2的表达呈负相关,这意味着YTHDF2在肝癌患者中可能上调.肝脏中FTO可抑制DEN(二乙基亚硝铵)诱导的HCC发展,还可能靶向Cul4a mRNA降低Cul4a蛋白水平,从而阻断细胞周期进程和增殖.因此,FTO-CUL4A轴可能是HCC治疗的一个有希望的靶点[39].YTHDF3可作为促癌因子,通过增强ZEB1 mRNA的稳定性来促进肝癌的迁移、侵袭和EMT过程[41].YTH家族的其他成员,如YTHDC1和YTHDC2,在肝癌发展中的参与尚需要进一步研究.

IGF2BP2过表达在体内外均能促进肝癌的增殖,其可能的机制为IGF2BP2直接识别并结合到FEN1(皮瓣内切酶1)mRNA上的m6A位点,增强了FEN1 mRNA的稳定性,而FEN1已被证明是促癌因素,促进肝癌的生长和转移.靶向METTL3-IGFBP2-FEN1通路可能是HCC治疗的一种新的有效策略[42].

以上的研究表明m6A修饰和m6A调节因子在肝癌发生中的复杂作用,m6A修饰和m6A调控因子参与调控癌细胞增殖、迁移、侵袭、EMT等过程.但是有些研究对同一种调控因子的表达和功能是矛盾的,并没有确切统一的定论.因此,m6A调控肝癌进展的机制有待进一步研究.

3 结论

近年来,RNA的m6A修饰越来越受到人们的关注,随着检测技术的提高和表观遗传学研究的进展,近年来有大量研究揭示了m6A修饰在肿瘤中的作用,包括肝癌.然而不同的m6A修饰酶在肝癌中的功能作用各异,并且十分复杂.m6A调控肝癌进展的机制有待进一步研究,未来的效应因子也需要识别癌症特异性的m6A修饰以进行早期诊断.另外,鉴于m6A修饰和调控在许多癌症中的关键作用,靶向失调的m6A调控可能是一种治疗癌症的选择.因此,更好地了解m6A可能会改善未来的癌症治疗.