中性粒细胞胞外诱捕网在缺血性卒中中的研究进展

梅建刚 综述 余刚 审校

重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆 400016

卒中是我国疾病负担最高的疾病之一，约1/3的卒中患者在发病3个月或1年内死亡或仍遗留残疾[1]。缺血性卒中(ischemic stroke)是主要的卒中类型，有限时间窗内的静脉溶栓及机械取栓等血管内再通治疗是改善预后的关键。溶栓或取栓并非总是可及；并且接受溶栓的患者中不到一半可实现早期再通[2]。开发新的治疗手段，以改善缺血性卒中患者预后，任重道远。中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)是有独特抗微生物作用的中性粒细胞胞外结构，近些年NETs 相关的文献报道数量几乎呈爆炸式增长[3]。随着研究的深入，发现NETs除了在感染性疾病中的作用，还与自身免疫疾病、动脉粥样硬化、血栓形成、肿瘤等密切相关[4-5]。而NETs 与缺血性卒中的关系也得到了广泛的研究；特别是NETs 形成并稳定血栓的作用，以及降解NETs 以实现血栓溶解的治疗潜能，已成为新兴的研究热点，可能成为新的治疗靶点。故现就NETs与急性缺血性卒中相关研究综述如下：

1 NETs概述

2004 年，BRINKMANN 等[6]发现并命名了NETs。它是由激活的中性粒细胞释放到胞外的网状复合体，其骨架为染色质纤维，并被球形蛋白颗粒修饰。NETs骨架亦可源于线粒体DNA；蛋白颗粒含有组蛋白、多种蛋白酶及抗菌肽[5]。在不同研究中已经发现约27种NETs 相关蛋白，其中主要有中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)、瓜氨酸化组蛋白3 (citrullinated histone 3，H3Cit)、H4Cit 和髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)等[7]。同时，这些蛋白、胞外DNA、核小体也成为检测NETs 的标志物。触发NETs 形成的物质包括细菌、真菌等微生物，免疫复合物以及活化的血小板、某些细胞因子等[3，8]。NETs 的形成过程复杂，涉及染色质解聚、核膜和质膜的破裂、MPO 与NE 介导的组蛋白裂解、组蛋白的瓜氨酸化修饰等步骤[9]。NETs 的网状结构可诱捕、固定病原体，颗粒中的分子则有抗微生物作用；而NETs 相关的组蛋白、NE、MPO、DNA等具有细胞毒性或免疫原性，当NETs过度积聚时，可引发宿主局部或全身病理改变[10]。

2 NETs在缺血性卒中中的作用

2.1 动脉粥样硬化疾病及动脉血栓形成中的NETs头颈部动脉粥样硬化和动脉血栓形成是急性缺血性卒中的重要病因。从人颈动脉内膜切除术得到的粥样斑块经组织免疫染色显示，NETs标志物包括胞外DNA、NE、H4Cit 与中性粒细胞标记物CD66b 共同定位于斑块中，证实NETs 存在于人颈动脉粥样斑块内[11-12]。动物实验显示，在动脉粥样硬化病变中，胆固醇晶体和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是诱导NETs形成的关键[13]。NETs通过多种途径促进动脉粥样硬化。其一，NETs能激活巨噬细胞释放多种细胞因子，导致免疫细胞的募集增加，从而加重动脉壁炎症反应[14]，促进动脉粥样硬化形成与进展。其二，中性粒细胞可被粥样硬化病变中活化的平滑肌细胞吸引、诱导释放NETs；而NETs 中的组蛋白H4 (H4Cit)则引起组织损伤，结合并溶解平滑肌细胞，从而导致动脉斑块不稳定[15]。其三，在富含平滑肌细胞的斑块中，NETs 还可以通过Toll 样受体-2 及补体依赖途径诱导氧化应激和内皮细胞凋亡，使斑块遭到侵蚀，出现糜烂[12]。同时，对人颈动脉组织的研究也发现，NETs 主要出现在浅表糜烂的斑块中，而不是富含脂质的斑块或易破裂的斑块中[11-12]。其四，NETs 中的组织蛋白酶G 还可协同IL-1α促进内皮细胞活化，增加组织因子的表达及其活性[16]。NETs 导致斑块的失稳以及内皮功能改变，不仅促进了动脉粥样硬化进展，而且增加了斑块并发血栓的风险[11，16]。 除了对斑块及内皮的作用，NETs 还可以通过其他途径促进血栓形成。首先，NETs 的染色质骨架为多种血栓前成分，如血小板、红细胞、纤维蛋白、von Willebrand因子，提供了附着与相互作用的平台，从而促进血栓形成[8]。其次，一方面，NETs 通过自身复杂的组分直接或间接激活并聚集血小板；另一方面，激活的血小板还刺激中性粒细胞释放NETs，从而形成促凝血循环[13]。而NETs 的促凝作用最终可以导致动脉闭塞。对颈内动脉急性闭塞的患者研究也提示，病变部位高凝环境形成与NETs 密切相关[17]；在小鼠颈动脉闭塞的模型中，予以组蛋白-DNA抗体拮抗NETs，还可以延迟颈动脉闭塞和需要血流重建时间[18]。

2.2 NETs与继发性微血管血栓形成在短暂性大脑中动脉闭塞的小鼠模型中[19]，动脉闭塞即刻引起了下游微血管白细胞相关血栓形成和血脑屏障破坏，进而引发微血管血栓炎症反应，导致再通后不完全再灌注。而使用能够降解NETs 骨架的DNase1 (脱氧核糖核酸酶1)能显著改善模型预后；输注NETs的组分-组蛋白则有相反作用[20]。据此，有学者推测，NETs 形成导致了大动脉闭塞后继发性微血栓形成[21]，进而出现缺血组织再灌注延迟和无复流[22]。

2.3 NETs 在卒中后神经炎症中的作用NETs还影响了卒中后的免疫细胞浸润、血脑屏障受损及神经元死亡等神经炎症环节。

2.3.1 NETs与免疫细胞浸润动物实验研究发现，对不同NETs形成环节的抑制，可减轻缺血损伤后的炎症反应。如使用全反式维甲酸抑制STAT1 信号通路，可减少NETs 形成，下调病灶中性粒细胞的积聚，并减少梗死体积，改善功能预后[24]。 使用Cl-amidine 抑制NETs 形成关键酶肽基精氨酸脱亚胺酶4，可以延迟免疫细胞浸润，并显著减轻血管损伤[25]，有助于新生血管生成及血管重塑，进而促进功能恢复[26]。

2.3.2 NETs 与血脑屏障受损人体尸检发现，NETs 标志物MPO 和NE 阳性细胞共同存于急性脑梗死患者缺血脑组织及血管周围间隙[22]。在急性缺血性卒中小鼠中，可见梗死半球从毛细血管管腔、血管周围间隙及脑实质的中性粒细胞浸润，伴有CitH3阳性、染色质解聚以及DNA和组蛋白的胞外投射等NETs形成特征；同时，在维持血脑屏障完整性的周细胞[23]周围观察到了NETs样结构，从而提示NETs可能参与了血脑屏障的损伤。

2.3.3 NETs与神经元死亡体外实验则发现，神经元遭到缺血损伤或死亡可促进NETs 形成，而NETs又能增加神经元的死亡，从而形成恶性循环[25，27]；在这一循环中，超急性期受损脑组织释放到胞外的细胞因子——高迁移率族蛋白1 (HMGB1)不仅可以触发NETs形成，还可作为NETs的一部分，介导神经元死亡[25]。

2.4 NETs与中风后免疫抑制卒中后出现了全身的免疫抑制，这被认为是减轻神经炎症以保护大脑的反应，但也增加了卒中后的感染风险[28]。而中性粒细胞释放NETs 能力的减弱，也可能是导致卒中后免疫抑制的原因之一[29]。卒中后升高的应激激素—儿茶酚胺和糖皮质激素介导了卒中后的免疫改变[30]。体外实验研究发现，儿茶酚胺和地塞米松抑制了健康受试者来源的中性粒细胞释放NETs，并且NETs 释放的减少可能与胞内参与形成NETs 的MPO 水平降低相关[31]。RUHNAU 等[29]则证实，与健康组相比，卒中患者外周血中性粒细胞在受刺激后产生的NETs水平在发病后第一天存在短暂的下降，在第5 天恢复正常。然而需要注意的是，虽然卒中后血浆NETs标志物，如血浆MPO、NE、DNA等显著升高，但循环中的NETs水平的升高并不能直接降低感染的风险。因为NETs利用带有高浓度抗菌分子的网状结构局限并杀灭病原体，是在局部组织其起用的[6]。再者，血浆NETs 标志物水平升高还可能由中性粒细胞数量增加及NETs降解增多引起[31]。

3 NETs的潜在临床价值

3.1 NETs与再通治疗抵抗再通治疗包括静脉溶栓及机械血栓等动脉内介入治疗。既往研究发现，血栓中高白细胞比例与大血管闭塞的卒中患者机械取栓更长的再通时间、更低的TICI 评分(thrombolysis in cerebral infarction score)和临床预后密切相关[32]。而其实，中性粒细胞是血栓成分中最大的白细胞亚群[33]。最近的三项研究[5，33-34]分析了接受血管内治疗卒中患者的血栓。组织学研究发现，中性粒细胞和NETs 标志物广泛存在于所有血栓中，而NETs标志物H3Cit阳性面积最高可占血栓截面总面积的13.45%[5]。其中两项研究[33-34]分别以血栓组织切片中单位面积H3Cit 染色阳性的数量及血栓溶解后NETs标志物NE的浓度计算NETs含量；二者均发现，血栓中NETs含量与再通所需时间和取栓设备通过次数呈正相关。这表明NETs作为血栓的重要组成增加了取栓治疗的抵抗。DNase1可溶解NETs 的DNA 骨架。PEÑA-MAR-TÍNEZ 等[2]发现，在富血小板血栓致小鼠卒中模型中，血栓形成后3 h分别予以赋形剂、tPA、DNase1，仅DNase1可有效促进血栓溶解，使闭塞血管再通，改善卒中预后。这提示NETs是富血小板血栓对tPA的抵抗原因，而DNase1能解除这类溶栓抵抗。体外实验也证实，无论梗死类型如何，DNase1都能独立显著地溶解卒中患者新鲜血栓，比tPA 更加有效(两者溶解比例75% vs 25%)；除此之外，DNase1还能加速tPA对卒中患者体外血栓的溶解[5，34]。而关于NETs 导致溶栓抵抗的机制研究如下：首先，此前的研究显示，组蛋白-DNA复合物还会导致纤维蛋白变粗，改善其稳定性和刚度，从而稳定形成的血栓，使血栓对机械和酶的破坏更具抵抗力[35]。再者，扫描电镜发现脑动脉血栓具有一层厚而致密的外壳[36]；而相应的，组织学染色显示，NETs在血栓外层尤为集中[34]；相对陈旧的血栓含有更多的中性粒细胞和NETs[5]。据此可推测，NETs 可能与血管壁相互作用进而导致取栓或溶栓抵抗。

3.2 循环NETs标志物的临床相关性多项研究提示，与对照组相比，急性缺血性卒中患者的血液循环中NETs 标志物明显升高，包括循环游离DNA(cf-DNA)、双链DNA (DsDNA)、核小体和CitH3、DNA-组蛋白复合物[37-39]。另有研究显示，出入院时的循环中NETs 标志物升高与卒中严重程度呈正相关；并且急性期citH3水平升高与一年内全因死亡率增加独立相关[37，39]。但是这些标志物的临床相关性研究尚存在矛盾，有待进一步研究。例如，在急性缺血性卒中患者中，JUANA 等[37]发现cfDNA、CitH3 等在年龄更高，伴有房颤、高血糖水平患者中显著升高；而王欢[39]发现cf-DNA水平升高水平与年龄、血糖及房颤病史等因素无明显相关性。

3.3 NETs 标志物与肿瘤相关缺血性卒中罹患肿瘤可导致全身高凝状态，增加缺血性卒中风险，而这种风险在肿瘤得到有效诊治前更高[40]。多项研究提示，NETs 对肿瘤相关缺血性卒的血栓形成有重要贡献。对8 例恶性肿瘤伴转移的卒中患者尸检发现，H3Cit阳性微血栓广泛存在于心、脑、肺的小动脉[41]，其中3 例肿瘤相关卒中患者为尸检后诊断；尚有个案报道称，H3Cit及上皮肿瘤标志物CK18共同存在于一例晚期前列腺癌的卒中患者脑小动脉微血栓中[42]。并且肿瘤相关缺血性卒中患者血浆H3Cit 水平显著升高，并与凝血酶-抗凝血酶复合物和可溶性P-选择素呈正相关[41]。类似的，另一研究则发现，NETs 标志物血浆DNA、核小体与D-二聚体水平独立正相关，显著高于健康对照组、肿瘤组对照组、卒中对照组；并且，血浆DNA水平升高还与肿瘤相关卒中独立相关[43]。然而，PARK 等[44]分别研究了16 例活动性癌症患者、16 例非活动性癌症患者、16例无任何癌症病史患者颅内血栓中的组织学特点，数据显示，80%的血栓H3Cit 阳性，但并未发现H3Cit阳性分数的组间差异。出现组织学及血浆NETs 标志物临床相关性研究矛盾的原因，或与肿瘤导致卒中的不同机制及各研究样本量较小等因素相关[44]。故血浆NETs 标志物水平可能对肿瘤相关卒中具有鉴别意义，尚需进一步研究。

4 展望

综上所述，NETs是缺血性卒中相关的动脉粥样硬化、血栓形成、再通治疗抵抗及卒中后神经炎症等环节的重要参与者。其中，鉴于DNase1 溶解血栓的能力，可考虑将DNase1 作为急性缺血性卒中再通治疗的药物，做进一步研究；而针对不同NETs形成途径的抑制剂或中和NETs 毒性成分的药物，可作为潜在神经保护剂；NETs标志物对缺血性卒中患者临床预后判断也具有一定的潜能。同时，也需要注意目前研究的局限性，如大量研究为体外或动物模型实验，不同的NETs 量化方式影响了不同研究的可比性。这些问题不仅为未来的研究提供了广阔的空间，更提出了不小的挑战。