荔枝核改善胰岛素抵抗治疗2型糖尿病的网络调控作用研究

邓志军，李阿荣，罗永佳，周毅业，郭洁文，刘若轩，李丽明，吴菲

(广州医科大学附属中医医院，广东 广州 510130)

本课题组前期研究发现：荔枝核具有改善糖、脂代谢紊乱，增强胰岛素敏感性和对抗自由基损伤等作用；荔枝核皂苷及其有效部位群可显著改善T2DM伴胰岛素抵抗(IR)模型大鼠糖脂代谢，增强胰岛素敏感性和葡萄糖利用能力，改善IR[1-4]。网络药理学技术是通过构建药物、成分、靶点、疾病、通路之间的复杂网络预测药物的作用机制，适用于中药复杂体系机制研究[5]。本试验拟通过网络药理学筛选荔枝核降糖的主要成分及作用靶点，根据“化合物-靶标-疾病”网络分析及GO信号通路富集分析荔枝核降糖的潜在机制，为荔枝核及其活性成分发挥降糖作用的分子机制研究提供新思路，并为进一步研发荔枝核降糖调脂的创新制剂奠定基础。

1 方法

1.1 荔枝核活性化合物及其靶向基因

BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php/Home/Index/index)是一个分析中草药活性成分、相关靶标的生物信息分析工具数据库[6]，它利用互联网的海量信息共享优势，通过数据挖掘将传统中药、方剂或者化合物进行线上交互，进而预测其微观分子机制和靶向蛋白位点，同时还可以将基因位点信息进行功能富集分析[4]。本研究根据 BATMAN-TCM 数据库的说明，输入“荔枝核”为关键词，利用数据库检索其成分数据，以阈值(score cutoff)>20、P<0.05为筛选标准，获得荔枝核的活性化合物及其靶向蛋白基因列表。

1.2 荔枝核活性成分降糖作用靶向基因预测与筛选

DisGeNET(http://www.disgenet.org/)整合了多个数据库的基因-疾病相关联性信息和大量文献，是一个收录人类疾病相关基因与突变位点信息的网络数据库平台[7]，可利用文本挖掘技术对相关疾病进行数据分析。通过该数据库，可以先获得与血糖相关的虚拟靶基因，然后与荔枝核活性化合物的靶向基因整合，所得的交集基因即为药物-疾病交集靶基因。

1.3 “化合物-靶标-疾病”网络的构建

Cytoscape是一款生物信息分析软件，可以整合信息模块网络和生物学科联系网络的绘制，表达成网络描述格式，还能够为这种网络格式添加注释信息，针对问题进行深入分析[8]。本试验利用Cytoscape3.6.1软件构建荔枝核降糖功效的“成分-靶点-疾病”网络图，进而呈现荔枝核 “多靶点、多途径、多层次”的整体调控作用。

1.4 荔枝核活性成分降糖靶点通路分析

利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)系统[9]，将通过上述方法获取的荔枝核降糖靶点信息进行生物分子功能注释。结合GO富集分析和KEGG通路注释分析，根据富集因子分析核心通路富集程度，探讨荔枝核降糖的作用机制。

2 结果

2.1 荔枝核主要活性成分及潜在靶点信息

将BATMAN-TCM所得荔枝核活性成分潜在靶点与DisGeNET数据库中搜到的与降糖相关的靶点比对分析，得到5种活性成分及597个可能与荔枝核治疗糖尿病相关联的靶点。荔枝核的主要活性成分包括：柏木醇、棕榈酸、苯甲酸、甲苯、4-甲基-3-戊烯-2-酮，靶点数目分别为26、226、18、58、263。荔枝核活性成分化合物-靶点蛋白网络关系图见图1。基于各靶点来源化合物数量发现，ESRRG、AKR1C2、AR、DBT等是荔枝核中5种活性成分的主要潜在作用靶点。荔枝核活性成分部分靶点信息及来源化合物数目等详见表1。上述结果体现出荔枝核多成分、多靶点的降糖作用机制。

2.2 成分-靶点-通路网络构建与分析

通过试验数据构建荔枝核“成分-靶点-信号通路”网络图，见图2。它由27个“节点”(5种成分，16个靶点及6种与降糖有关通路)和64条“边”构成：3种颜色分别代表荔枝核的活性成分、潜在靶点及相关通路，“边”代表三者间交互作用。结果显示网络节点度排名靠前的是GABRB2、GABRB3这2个靶点，为网络枢纽节点，提示其可能是荔枝核降糖的核心作用靶点。每个活性成分对应多个靶点，每个靶点联系多种成分，体现了荔枝核多成分、多靶点降糖作用机理，各通路间既共有靶点又不相互独立，更说明通路间协同发挥相互作用。

注：红色菱形代表化合物，蓝色椭圆形为靶点蛋白。

表1 荔枝核活性成分部分靶点信息

2.3 生物功能与通路分析

2.3.1 GO 富集分析 将BATMAN-TCM所得荔枝核活性成分、靶点以DAVID平台进行GO富集分析，结果有生物学过程(biological process)、细胞组分(cellular component)和分子功能(molecular function)，见图3。结果显示，生物学过程中解剖结构发育(anatomical structure development)和压力反馈(response to stress)等作用突出；细胞组分中细胞(cell)和细胞质(cytoplasm)较重要；分子功能中离子结合(ion binding)等功效显著。

2.3.2 信号通路分析 KEGG通路注释分析[10]结果提示：共32条相关信息通路与目标成分预测靶点有关，其中16条相关信息通路频率较高，又可分为8类。内分泌系统通路3条，为卵巢类固醇生成、雌激素和催产素信号通路；神经系统相关通路有6条，分别为逆行内源性大麻素信号转导和5条突触通路；信号转导相关通路有2条，为钙信号通路和CGMP-PKG信号通路；与信号分子与相互作用相关的通路有1条，为神经活性配体-受体相互作用；循环系统相关通路有1条，为心肌细胞肾上腺素能信号转导；脂质代谢相关通路有1条，为类固醇激素生物合成；环境适应相关通路1条，为昼夜夹带；能量代谢相关通路1条，为氧化磷酸化。具体分析结果见表2。

注：黄色菱形为化合物，蓝色椭圆形为靶点蛋白，绿色正方形为信号通路。

3 讨论

荔枝核有效部位群可以调节糖脂代谢、改善IR，与抑制胰腺组织内质网应激关键基因葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)及C/EBP同源蛋白(CHOP)mRNA 的表达关系密切[1-4]。本研究筛选出荔枝核5种活性成分及597个可能与荔枝核治疗糖尿病相关联的潜在靶点，其主要活性成分包括：柏木醇、棕榈酸、4-甲基-3-戊烯-2-酮、苯甲酸、甲苯，而ESRRG、AKR1C2、AR、DBT等应是荔枝核中5种活性成分的主要潜在作用靶点。

雌激素是女性内分泌系统的重要激素之一，它通过其受体发挥多种生物学效应。在妊娠早期雌激素可上调胰岛素受体，提高胰岛素敏感度；在怀孕中晚期，体内升高的雌激素会抵消孕激素的部分作用，降低身体血糖利用能力， 发生妊娠糖尿病[11-12]。雄激素维持糖脂代谢，其作用主要是通过AR介导。醛酮还原酶(aldo-keto reductase，AKR)是酮还原酶超家族成员之一，包括糖尿病慢性并发症在内的多种疾病的发生与它的激活关系紧密。研究认为AKR与AR的合成与代谢关系紧密，还参与其信号通路，作为AR合成途径之一的后门通路(backdoor pahtway)就与AKR1C2有联系[13]。γ-氨基丁酸(gamma-aminobu-tyric acid，GABA) 是一种神经递质，它通过GABA细胞膜极化过程调节胰岛细胞的分泌，最终达到双向调节血糖的目的[14-18]。糖尿病就是经由 GABA 调控胰岛素的释放和 GABA抗原的表达来实现，所以通过GABA进行相应治疗可延缓由糖代谢受损和氧化应激导致的糖尿病及其并发症的发生发展[19]。

图3 荔枝核活性成分GO富集分析结果

表2 荔枝核活性成分相关通路的分类及信息

荔枝核网络药理的相关通路分析结果提示：共32条相关信息通路与目标成分预测靶点有关，其中CNR1 系统失调与多种代谢性疾病有关，如IR和炎症，而这些因素也是 T2DM 的危险因素[20-21]。胰高血糖素样肽1(GLP-1)受体激动剂是糖尿病的新药，功效明显、优势突出。内源性大麻素系统中含有2种G蛋白偶联大麻素受体(CNRs)，可以调节下丘脑和肥胖、新陈代谢等，其中CNR1主要位于人体大脑的几个区域和包括脂肪在内的多种外周组织中，和GLP-1受体激动剂的疗效相关[22-23]。脂质代谢相关通路有1条：类固醇激素生物合成；SHBG是专门负责运输性激素的一种球蛋白，可调控性激素的水平[24]。研究显示，T2DM 男性患者的SHBG显著减少，而雌激素明显增加。男性特别是老年男性体内AR和SHBG的水平下降，是T2DM的危险预测因子[25-27]。

能量代谢相关通路有1条：氧化磷酸化。它能释放能量供给ADP、合成ATP，主要在线粒体中完成。糖尿病是一种慢性高血糖状态，以线粒体的基因突变最多见。糖尿病血管病的早期发病及最终临床表现中均与线粒体功能紊乱有关，两者的病理表现形成恶性循环又互为因果[28-29]。已知的糖尿病发病原因比较复杂，其中IR、β细胞功能与线粒体功能联系密切，故改善IR和β细胞功能对糖尿病意义重大[30]。

环境适应相关通路的昼夜夹带是一种生物节律，紊乱的生物节律会降低糖耐量，胰岛素异常分泌，最终造成糖代谢紊乱[10]。糖尿病和生物钟节律相关，昼夜失调增加糖尿病的风险和炎症，不规律生活特别是长期夜生活的人群体内的昼夜周期会发生变化，破坏胰岛生物钟的功能，降低胰岛分泌质量和数量，肥胖也会与之共同促进β细胞衰竭，这些都是胰岛生物钟损伤的结果[31-33]。另外，胰岛素分泌的正常节律是维持血糖生理稳态的关键因素之一，昼夜节律系统调节胰岛素分泌昼多夜少，揭示“昼-夜”周期糖耐量-胰岛分泌的内在规律，这种规律的紊乱会导致T2DM发生[34]。

本研究结果显示了荔枝核“多成分-多靶点-多通路”的降糖作用特点，可为下一步明确荔枝核活性成分治疗糖尿病靶点及机制验证研究提供理论依据。