龙虎人丹改善高脂饮食诱导的脂肪细胞肥大的作用研究

王刚，程伟，于泽，丁礼琴，金家骅，金桂芳

(1.江西省高安市中医院，江西 高安 330800； 2.广东药科大学，广东 广州 510006； 3.上海中华药业有限公司，上海 201707)

肥胖是一种临床常见的慢性代谢性疾病，肥胖常伴随或并发糖尿病、高血压、非酒精性脂肪肝、高脂血症和心脑血管等疾病，还会增加肿瘤的发病率[1]。由于高热量饮食的大量摄入以及久坐不动的生活方式，目前，全球范围内约有1.077亿儿童和6.037亿成人发展为肥胖人群，肥胖总体患病率分别为5%和12%[2-4]。如何减肥也日益成为我国卫生健康领域的一大难题。然而，除了控制饮食和加强锻炼,临床尚缺乏药效明确、副作用小的减肥药物[5]。

肥胖的主要特点是脂肪组织重量增加，体脂占比明显升高，而脂肪细胞储存的三酰甘油含量持续增加导致脂肪细胞不断肥大是引起脂肪组织重量增加的主要原因[6]。脂肪细胞的主要特征是它们能够以三酰甘油的形式储存多余的热量，这些三酰甘油被包装成占据脂肪细胞内大部分空间的脂滴[7]。在高热量摄入的早期阶段，脂肪细胞会积极地储存额外的三酰甘油，并在禁食期间保持接近正常脂质代谢率；随着热量摄入的持续增加，脂肪细胞会因三酰甘油过度沉积而肥大，并引起脂肪组织重量及占比不断升高[5-6]。

龙虎人丹是一种中草药复方，主要由薄荷、冰片、丁香、砂仁、八角茴香、肉桂、胡椒、木香、干姜、儿茶和甘草等11种成分组成，在临床上广泛应用于治疗中暑、晕动病、腹泻等病症，具有疗效可靠、副作用少、复发率低等优点[8-9]。之前的研究表明，龙虎人丹可通过调节血脂代谢进而改善高脂饮食诱导的小鼠动脉粥样硬化中的血脂紊乱即能显著降低血清三酰甘油、总胆固醇和低密度脂蛋白[10]。然而其对于肥胖小鼠中脂肪细胞肥大的保护作用及相关分子机制尚未有报道。因此，本研究旨在评价龙虎人丹改善高脂饮食诱导的小鼠脂肪细胞肥大的药理作用，并进一步探究其分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

24只SPF级雄性C57BL/6小鼠，体质量20～25 g，8周龄，购自广州中医药大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(粤)2018-0034。

1.2 药品与试剂

龙虎人丹由上海中华药业有限公司提供(批号：161006)；苏木素伊红(H&E)染液(北京雷根生物技术有限公司，批号：0729A20)；脂联素ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，批号：S22017306)；SYBR Green supermix(美国Bio-Rad公司，批号：64309999)；D12492高脂饲料(Research Diets 公司，批号：150300288)；anti-β-actin 抗体(北京全式金生物技术有限公司，批号：O10313)；anti-CD36抗体(美国CST公司，批号：1875S，2138S)；HRP标记羊抗兔、羊抗鼠二抗(美国Promega公司，批号：0000390794，0000379490)。

1.3 主要仪器

MULTISKAN GO 全波长酶标仪(美国Thermo Scientific)；LC480荧光定量PCR仪(瑞士Roche)；微型蛋白电泳转印系统(美国Bio-Rad)；3300029-7Q化学发光仪(上海勤翔科学仪器有限公司)；BX-53荧光显微镜(日本Olympus)；BN-5188冰冻切片机(孝感市亚光医用电子技术有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 分组及给药 将24只小鼠随机分为4组，每组6只，分别为：正常对照组、模型组、龙虎人丹低剂量组(20 mg/kg，相当于成人临床最低剂量的9倍)和龙虎人丹高剂量组(40 mg/kg，相当于成人临床最高剂量的9倍)，每天固定时间进行灌胃给药，持续16周。除正常对照组外，其余小鼠均用高脂饮食喂养16周，以诱导小鼠肥胖模型[11]。龙虎人丹使用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)稀释。此外，在整个实验过程中，正常对照组和模型组均灌胃给予0.5%CMC-Na。

小鼠麻醉后进行眼眶取血，血样室温保存30 min后，3 000 r/min离心15 min，收集血清，采集的血清样本在-80 ℃下保存，以备后用。然后脱颈椎处死小鼠，取出附睾白色脂肪组织，用生理盐水冲洗，液氮速冻后储存于-80 ℃冰箱中。部分附睾白色脂肪组织在4%(φ)多聚甲醛溶液中固定24 h后以有机溶剂梯度脱水。

1.4.2 组织病理学检测 按上述处理方法将部分附睾白色脂肪组织固定于4%多聚甲醛溶液(4 ℃)中过夜，梯度脱水后石蜡包埋，切片(4 μm)后进行HE染色。脂肪细胞相对面积用ImageJ进行定量分析。

1.4.3 脂联素测定 按前述方法获得小鼠血清样本。血清脂联素含量采用商品化脂联素ELISA试剂盒依据说明书进行测定(武汉华美生物工程有限公司)。

1.4.4 小鼠体脂比分析 将小鼠置于EchoMRI动物组分分析仪(EchoMRIIM，中国上海)的测定槽固定后，压紧测定槽使其无法活动，将测定槽推入动物组分分析仪后测定小鼠的体脂比。

1.4.5 荧光定量PCR[12]以TRIzol法提取各组小鼠部分附睾白色脂肪总RNA并使用PrimeScriptTMgDNA逆转录试剂盒进行逆转录并获得cDNA。使用SYBR Green法进行荧光定量PCR检测。所使用的引物如表1所示。以β-actin为内参，使用2-△△Ct法计算每个mRNA的相对表达量。

表1 荧光定量PCR中使用的引物序列

1.4.6 Western blot分析[12]脂肪组织浸没在RIPA裂解液中进行匀浆，4 ℃、12 000 r/min离心30 min后收集上清液。BCA法进行定量，取等量总蛋白(20～40 μg)进行SDS-PAGE凝胶电泳。湿法转膜后用5%脱脂奶粉封闭，一抗4 ℃孵育过夜，第2天经二抗孵育后用ECL发光液进行检测。

2 结果

2.1 龙虎人丹对高脂诱导小鼠体脂比的影响

与正常对照组相比，模型组小鼠的体脂比显著升高(P<0.01)；与模型组相比，龙虎人丹低、高剂量组小鼠的体脂比明显降低(P<0.01)，说明龙虎人丹可以有效逆转高脂饮食引起的脂肪组织质量增加。见图1。

2.2 龙虎人丹对高脂诱导小鼠血清脂联素的影响

与正常对照组相比，模型组小鼠血清脂联素水平显著降低(P<0.01)；与模型组相比，龙虎人丹低、高剂量组小鼠的血清脂联素含量明显上升(P<0.01)。以上结果提示，龙虎人丹可促进高脂诱导小鼠脂肪组织分泌脂联素。见图2。

1.正常对照组； 2.模型组； 3.龙虎人丹低剂量组； 4.龙虎人丹高剂量组。与正常对照组比较：##P<0.01； 与模型组比较：**P<0.01。

2.3 龙虎人丹对高脂诱导小鼠脂肪细胞肥大的影响

脂肪组织HE结果显示，与正常对照组相比，模型组小鼠脂肪细胞明显肥大且细胞相对面积显著增加(P<0.01)；与模型组相比，龙虎人丹低、高剂量组小鼠脂肪细胞明显减小，细胞面积定量分析也进一步证实龙虎人丹能够有效抑制高脂饮食诱导的脂肪细胞肥大(P<0.01)。见图3、4。

1.正常对照组； 2.模型组； 3.龙虎人丹低剂量组； 4.龙虎人丹高剂量组。与正常对照组比较：##P<0.01； 与模型组比较：**P<0.01。

1.正常对照组； 2.模型组； 3.龙虎人丹低剂量组； 4.龙虎人丹高剂量组。

2.4 龙虎人丹对高脂诱导小鼠脂肪组织脂质代谢相关基因表达的影响

与正常对照组相比，模型组小鼠脂肪组织中脂质合成基因PPARγ和ACC的mRNA表达明显增加(P<0.01)，脂质摄取基因CD36的mRNA和蛋白表达均明显上调(P<0.01)，作为三酰甘油降解的第一步也是限速酶，ATGL的mRNA表达则明显下调(P<0.01)；与模型组相比，龙虎人丹低、高剂量组小鼠PPARγ、ACC的mRNA表达以及CD36的mRNA和蛋白水平均明显下调(P<0.05或P<0.01)，而ATGL的mRNA水平也显著上升(P<0.01)。以上结果表明，龙虎人丹可以改善高脂饮食诱导的小鼠脂肪组织脂质代谢基因的紊乱。见图5、6。

1.正常对照组； 2.模型组； 3.龙虎人丹低剂量组； 4.龙虎人丹高剂量组。与正常对照组比较：##P<0.01； 与模型组比较：**P<0.01。

A. PPARY; B. ACC; C. CD36; D. ATGL。1.正常对照组； 2.模型组； 3.龙虎人丹低剂量组； 4.龙虎人丹高剂量组。与正常对照组比较：##P<0.01； 与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。

1.正常对照组； 2.模型组； 3.龙虎人丹低剂量组； 4.龙虎人丹高剂量组。

3 讨论

长期摄入高热量饮食会引起肥胖、高脂血症、糖尿病和非酒精性脂肪肝等一系列代谢性疾病[6,13]。龙虎人丹中的胡椒是一种常见的香料，具有抗氧化和降血脂等作用[14]。最近有研究表明丁香提取物能有效抑制棕榈酸诱导的脂质积聚[15]；肉桂的药用历史悠久，其主要有效成分肉桂醛具有抗氧化和抗炎作用，同时对改善糖代谢和脂质分布也有重要作用[16-17]；木香是菊科植物木香的干燥根，最新研究证实木香可以改善血糖和血脂[18]；儿茶是豆科植物儿茶的去皮枝、干的干燥煎膏，能显著抑制三酰甘油的吸收[19]。龙虎人丹可以明显改善小鼠动脉粥样硬化中的血脂异常[10]。鉴于龙虎人丹的药理效用及其对脂质代谢的重要调节作用，本文研究了其对高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂肪细胞的影响。

本研究发现，龙虎人丹能够显著抑制高脂饮食诱导的肥胖小鼠的脂肪细胞肥大并能改善脂肪组织中的脂质代谢紊乱：(1)龙虎人丹能够显著降低肥胖小鼠的脂肪占比；(2)龙虎人丹可以明显减轻高脂饮食诱导的脂肪细胞扩张和肥大；(3)龙虎人丹治疗后，肥胖小鼠脂肪组织中因高脂摄入引起的脂代谢基因表达紊乱得到明显改善。

脂联素是脂肪细胞分泌的一种重要的细胞因子，也是外周血中含量最高的脂肪细胞因子[20]。脂联素是机体脂肪组织质量增加时唯一呈负相关的脂肪细胞因子，脂联素作为一种胰岛素超敏化激素，可以促进骨骼肌细胞脂肪酸氧化和糖吸收，是机体脂质代谢和血糖稳态调控网络中的重要调节因子[21]。同时，脂联素能明显降低外周血中三酰甘油和低密度脂蛋白含量，增加高密度脂蛋白含量,减轻动脉粥样硬化病变[22]。本研究表明，龙虎人丹能明显改善高脂饮食引起的脂联素分泌减少，从而提高脂肪酸氧化的效率，也提高了三酰甘油利用率，最终明显减少脂肪细胞内三酰甘油的储存。

CD36是参与脂肪酸代谢的各种组织表面重要的脂肪酸转运体,介导这些组织对脂肪酸的摄取[23]。细胞表面CD36的表达增多会加速细胞对脂肪酸的摄取，并显著增加细胞内三酰甘油的合成，造成脂质过度堆积和细胞脂毒性[24]。本研究显示，龙虎人丹在一定程度上逆转了高脂饲料喂养的小鼠脂肪组织CD36的高表达，进而减轻细胞内脂质堆积并抑制脂肪细胞肥大。

综上所述，本研究表明龙虎人丹可以减轻高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂肪细胞肥大的组织病变程度，并显著改善肥胖小鼠脂肪组织中的脂质代谢紊乱。由于目前还没有针对肥胖的特效药，因此，龙虎人丹有望成为新型安全有效的减肥药物。