渗透压选择性裂解法在MALDI-TOF MS直接鉴定血培养阳性标本中的应用

张丽娜，陈莎，杨柳，胡成进(.杭州迪安医学检验中心，杭州 3003；.解放军第九六〇医院检验科，济南 50000)

血流感染(blood stream infection，BSI)具有较高发病率和死亡率，我国院内BSI致死率可高达30%～40%[1]。据文献报道，BSI病原菌鉴定报告时间每延迟1 h，患者存活率降低7.6%[2-3]。因此，准确快速鉴定病原菌及合理的抗菌药物治疗对于BSI患者的生存率和预后极其关键。目前，BSI诊断的金标准依然是血培养，而实验室传统方法是阳性血培养标本分离培养出单克隆菌落后进行生化鉴定和药敏试验，一般耗时48～72 h，极大地延迟血培养阳性结果的报告时间，从而可能耽误患者的后续治疗。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是一种近年来发展的新技术，可用于微生物病原菌的鉴定，已成为国内外学者研究的热点之一。本研究尝试使用渗透压选择性裂解法直接用于MALDI-TOF MS检测，可极大地缩短血培养阳性周转时间(turn-around time，TAT)，为临床抗感染治疗提供可靠依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2018年12月至2019年3月杭州迪安医学检验中心微生物室送检的阳性血培养瓶179例，剔除同一患者短时间送检的多套血培养标本。

1.2仪器与试剂 Vitek 2 compact全自动微生物分析系统及配套鉴定卡、Bact/ALERT3D全自动血培养仪(法国生物梅里埃公司)，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪及基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)(珠海美华公司)，甲酸、乙腈、三氟乙酸(Sigma公司)，快速革兰染液(珠海贝索公司)，血琼脂平板、麦康凯平板、巧克力平板(郑州博赛公司)。

1.3方法

1.3.1血培养涂片染色镜检 血培养仪阳性报警后，取出血培养阳性报警瓶抽取培养液涂片行革兰染色，记录镜检结果，排除假阳性干扰。

1.3.2传统血培养鉴定 根据涂片结果，转种哥伦比亚血琼脂平板和巧克力平板，置于CO2环境中培养18～24 h，选择适合鉴定板条，用Vitek 2 compact全自动微生物分析系统进行鉴定，记录结果。

1.3.3MALDI-TOF MS 取出阳性血培养瓶混匀后，注射器抽取1.5 mL培养液于1.5 mL EP管中(a)，600×g离心10 s，将上清液转移至新的1.5 mL EP管中，3 000×g离心60 s后弃上清液(b)，加入1.5 mL裂解液(8.29 g NH4Cl，0.037 g EDTA-2Na，1 g KHCO3溶于1 L蒸馏水配制而成)，室温放置3 min后3 000×g离心60 s，弃上清液(c)。加入900 μL乙醇重悬，13 000 r/min离心2 min，弃上清液，再次离心，使用移液枪完全去除残余的上清液，整个过程不应触碰沉淀，室温下干燥沉淀2～3 min，加入70%甲酸和乙腈，吹打混匀，13 000 r/min离心2 min，吸取1 μL蛋白质溶液(d)，点样于MALDI靶板上，干燥后加入1 μL HCCA基质溶液，室温干燥，采用质谱仪进行检测。

质谱仪参数设置：线性正性模式，氮激光器波长377 nm，采集相对分子质量为2 000～20 000的蛋白质指纹图谱，采集到的谱图通过软件进行校正，然后与数据库中的图谱进行比对。软件根据微生物鉴定得到相应分数，判断分数越高，鉴定准确性的可信度越高：1.7分以下不可信，1.7～2.0属水平可信，大于2.0种水平可信。

1.4统计学分析 用SPSS 23.0统计软件进行。计数资料以率表示，率的比较采用四格表的卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1革兰染色与传统鉴定法结果 共179例血培养瓶呈阳性结果，其中3例为混合菌感染，1例为厌氧菌感染，2例涂片未找到细菌，查看梅里埃血培养仪报阳曲线发现，其曲线不连续，为假阳性结果。另外包括83例(47.1%)革兰阴性杆菌，72例(26.7%)革兰阳性球菌，1例(0.57%)革兰阴性球菌，11例(6.3%)革兰阳性杆菌，6例(3.4%)真菌，经过16～24 h转种培养后采用Vitek 2 compact全自动微生物分析系统可以鉴定出所有细菌。

2.2前处理除杂效果及MALDI-TOF MS的谱图对比 以1例外周血培养大肠埃希菌为例，通过整个前处理操作过程中的外观比对，可见在第d步骤时除杂效果达到最好，得到的谱峰丰度最高，鉴定分值最优。见图1。

注：A，血培养阳性标本原液；B，血培养阳性标本原液低速离心后沉淀；C，血培养阳性标本原液经低速离心、裂解液裂解、离心后沉淀；D，血培养阳性标本原液经低速离心、裂解液裂解、甲酸萃取、离心后上清。

2.3MALDI-TOF MS鉴定结果 174份单种菌血培养的种、属水平鉴定的符合率分别是67.8%(118/174)、85.1%(148/174)。革兰阴性杆菌的种、属水平鉴定的符合率是74.7%(62/83)、91.6%(76/83)，其中临床常见菌株大肠埃希菌的种、属水平的符合率是90.6%(29/32)、96.9%(31/32)，肺炎克雷伯菌的种、属水平符合率是72.7%(8/11)、81.8%(9/11)，铜绿假单胞菌的种、属水平符合率是80%(4/5)、100%(5/5)，洋葱伯克霍尔德菌的种、属水平符合率是68.8%(11/16)、87.5%(14/16)；革兰阳性球菌的种、属水平鉴定符合率是69.4%(50/72)、80.6%(58/72)，其中人葡萄球菌的种、属水平的符合率是73.7%(14/19)、78.9%(15/19)，头状葡萄球菌的种、属符合率是80%(12/15)、86.7%(13/15)，粪肠球菌的种、属水平符合率是66.7%(4/6)、83.3%(5/6)，革兰阳性杆菌的种、属水平符合率是27.3%(3/11)、63.6%(7/11)，念珠菌的种、属水平符合率是33.3%(2/6)、100%(6/6)。3例复合菌感染的血培养阳性鉴定分值均小于1.70，结果不可信。鉴定结果见表1。革兰阳性杆菌鉴定种水平的准确率显著低于革兰阴性杆菌(P<0.05)和革兰阳性球菌(P<0.05)，而革兰阴性杆菌鉴定种水平的准确率略高于革兰阳性球菌，且差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 质谱鉴定结果

3 讨论

MALDI-TOF MS的最大优势在于可直接鉴定血培养瓶中的病原菌，省去了转种于固体培养基孵育的时间，为临床争取时间。大量文献[4-5]表明，不同的标本预处理方法可用于MALDI-TOF MS直接鉴定血培养阳性瓶病原菌，而不需要转种培养；前处理方法不同，MALDI-TOF MS鉴定的准确率也会有所差异。本研究使用渗透压选择裂解法预处理对血培养阳性瓶中的病原菌进行直接鉴定，首先根据细胞密度的差异，离心后细菌菌体位于沉淀上层，然后利用氯化铵溶液进一步裂解残余的血细胞，获得相对较纯的细菌菌体，最后采用甲酸萃取法提取细菌蛋白质进行MALDI-TOF MS直接鉴定。甲酸萃取法的目的是破坏细菌细胞壁，产生更多蛋白质谱，并且甲酸提取法中水和乙醇能洗掉培养基内的杂质，2种溶剂混合作用可以将菌体表面和细胞内的高峰强度的蛋白质提取出来，当细菌量少、70%甲酸和乙腈的量多时，会产生强度不够的峰。如果细菌数量太大而70%甲酸和乙腈的量少时会造成检测器的饱和，从而只有优势峰被检测到，后者还会造成MALDI-TOF MS系统的污染，干扰鉴定准确性。本研究参照文献报道，70%甲酸和乙腈的量为菌体沉淀的6倍，鉴定准确性最好[6]。

本研究对174例单种菌阳性血培养直接进行MALDI-TOF MS鉴定，结果显示革兰阳性杆菌鉴定种水平的准确率显著低于革兰阴性杆菌，这与国内外学者的研究相符合[7]，可能与革兰阴性杆菌生长速度快，相对比较容易达到MALDI-TOF MS鉴定的检出限有关。另外，部分质谱得分低的革兰阴性杆菌，可能由于80%的血培养瓶含有活性炭或树脂等抗菌药物吸附剂，但其中的活性炭成分可能会干扰蛋白质谱峰。对真菌的鉴定效果不理想，可能因为：(1)真菌的细胞壁比较厚，结构坚韧，不能很好地与甲酸结合，从而蛋白质不能完全被释放出来；(2)真菌生长缓慢，血培养瓶中数量少导致靶点涂抹时不均匀，不能形成良好的结晶谱图[8]；(3)本实验使用的国产质谱仪所使用的数据库不完善。但是鉴于本研究中样本数量较少，无法进一步验证。

本研究对3例复合菌的鉴定，没有1例鉴定成功。MALDI-TOF MS不适合作复合菌感染的鉴定[9]，而Schubert等[10]在研究中提出应用新的计算程序和新的数据库直接鉴定混合感染的血培养标本，此研究为MALDI-TOF MS直接鉴定混合菌感染的血培养阳性标本提供了可能。另外，本研究发现1株被鉴定错误的大肠埃希菌(得分为2.02分)，实际上梅里埃仪器结果是99%的日勾维肠杆菌，这可能与本文使用质谱仪的数据库中参考指纹图谱数量少有关。另外，由于成本问题，本研究中没有用第3种方法来验证鉴定结果的可靠性，以及样本量较少，使得统计结果可能有所偏差，有待于进一步验证。

综上，MALDI-TOF MS 采用渗透压裂解法对血培养阳性标本直接鉴定，大大缩短了TAT，有助于临床医生对BSI患者作出及时准确的判断，适宜在微生物室常规开展。但是，血培养瓶成分、样品的前处理方法、质谱仪型号、判断标准的差异均会对鉴定结果产生影响，有待进一步优化方法，提高质谱鉴定准确性。