多组分超分子药物水凝胶的构建及其用于灭血吸虫尾蚴药物缓释研究

胡小涛 李海龙 谭 悦

(1.赣南师范大学化学化工学院，江西 赣州 341000；2.江西润泽药业有限公司，江西 赣州 341000)

血吸虫病广泛存在于热带、亚热带地区，感染该病后死亡人数已超过2.8万人，是一种严重危害人类健康的传染病。现今，世界卫生组织(WHO)已将该传染病列为易复发传染病[1]，尾蚴期是血吸虫生命周期中唯一的感染期。目前，已报道了一些可用于预防控制和杀死水面尾蚴的药物，例如氯硝柳胺，吡喹酮等[2]。但是，这些药物在水中的溶解性差、价格昂贵、灭尾蚴时间短，难以大面积使用。因此，提高载药量和药时特性对防治血吸虫病具有重要意义。

1 水凝胶简介

水凝胶具有优异的物理化学性能，其三维空间结构可作为细胞、药物吸收和释放的基质材料，且具有良好的生物相容性[3-6]。因此，它在组织工程、药物释放和细胞三维培养等方面具有重要的应用前景[7-11]。水凝胶的主要驱动力为分子间氢键、范德华力、π-π堆积作用、积作用、金属配位作用、主客体相互作用和离子相互作用。它具有分子间相互作用能力强、合成工作量相对较小等优点。

水凝胶分为单组分凝胶和多组分凝胶，单组分凝胶是由溶液中的凝胶因子通过非共价键相互作用驱动产生的凝胶化物质，多组分凝胶是由两个或两个以上凝胶因子之间通过非共价键相互作用自组装形成的具有三维网络结构的稳定组分。

低分子凝胶是在溶液中通过各种非共价键作用力自组装形成三维网络结构的半固态材料。其经常表现出对外界环境如温度、光照、pH等的响应，在分子水平上构造和修饰低分子凝胶的化学结构以及在纳米尺度上调控低分子凝胶的自组装结构并不复杂。它还具有良好的高响应性和可修饰性，在药物释放、组织工程和细胞培养等领域显示出巨大的潜力。此外，低分子凝胶的发展还受到机械强度的限制。

2 凝胶因子介绍

氨基酸是一种生物相容性好、易修饰的化合物。通过对其羟基、羧基和酰胺基的官能团进行修饰，引入结构片段，进一步获得反应位点。氨基酸衍生物作为一种低分子凝胶剂，是利用C=O和N-H氢键自组装而成的稳定水凝胶优良材料，是最具特色的生化材料之一，在细胞培养、药物释放和生物医学成像等方面有着广泛的应用。NAAPD是由天冬氨酸与3，4，9，10-花四羧酸酐在一定条件下反应生成的，NAAPD的结构表明，它由两部分组成：具有显著的π-π堆积能力的苝和在凝胶化过程中作为氢键供体和受体的末端羧基。

石墨烯(GO)是一种新型的碳族单层二维纳米材料(其结构如图1)。大量的研究者对其深感兴趣，故掀起了一股GO的研究热潮[12]。石墨烯是一种由碳正环己烷构成的二维纳米材料，GO表面含有许多可修饰的含氧官能团，具有良好的水溶性和生物相容性。目前，GO在基因转移方面取得了优异的成果，具有载药、生物成像和光热疗法等功能。近年来，由于GO具有较高的比表面积、多个含氧官能团以及良好的生物相容性等优点，关于GO的报道越来越多，GO在药物传递中也得到了相当大的关注。在载药和释药方面表现出来的机械性能也是极其重要的，多个含氧官能团导致碳正环已烷的排列不均匀，因此，设计分子来修饰GO使其作为药物载体材料是提高GO力学性能的一种方法。Wan等人用小分子自组装法制备了环氧石墨烯，结果表明材料的力学性能得到了显著改善[13]。

因此，本研究设计了N，N-天冬氨酸-3，4，9，10四羧酸二亚胺(NAAPD)作为目标分子修饰石墨烯(GO)，以获得NAAPD/GO双组分超分子水凝胶，得到其优异的力学性能。本文利用氨基酸衍生物通过自组装行为构建水凝胶，分别探讨其力学性能、药物释放过程和防治血吸虫病的能力，通过光谱和显微镜技术测定或表征了水凝胶的化学组成和结构。

3 实验细节

3.1 合成方法

NAAPD和GO的合成分别参考Li等人[14]和Hummers等人[15]的详细方法，NMD的合成则使用本实验室之前报道过的方法进行[16]。

3.2 傅里叶红外光谱

在室温下，在AVATAR 360 FT-IR分光光度计(美国威斯康星州麦迪逊市Nicolet)上使用KBr片进行FT-IR光谱分析。

3.3 凝胶的扫描特性

将水凝胶滴在圆柱形铜基片的平面上制备扫描电镜样品，通过扫描电子显微镜(FEI，QUANTA 450，Hillsboro，OR，USA)在加速电压为20.0 kV的情况下观察样品的形态。

3.4 流变性质

通过冷冻干燥将新制的水凝胶干燥3小时，之后使用MSP-1S磁控溅射镀膜机(日本东京)对样品进行镀金处理，再使用板直径为35 mm 的HAAKE RheoStress 6000流变仪(德国奥芬堡)测量其流变特性。在25℃下，0.01～10hz范围内对新形成的水凝胶进行频率扫描测量。应变振幅设置为1%，时间扫描测量的频率设置为6.28rads-1，应变为30%。

3.5 X射线衍射分析

在Bruker-D8聚焦衍射仪上，用CuKα射线衍射仪对干燥后的有机凝胶进行了小角X射线衍射(SA-XRD)分析。

3.6 核磁共振

在室温下，在400 MHz的ULTRASHIELD 400(Bruker，Zürich，Switzerland)光谱仪上记录了核磁共振谱(NMR)。

3.7 凝胶化研究

对NAAPD和GO在复合溶液(THF/H2O=1/1)中的凝胶化进行了研究。为了制备不同NAAPD/GO摩尔比的水凝胶体系，在玻璃管中称取大量NAAPD和GO，加入0.5mL四氢呋喃(THF)后加入相当量的二次蒸馏水，在室温下超声振动6h。结果表明，在1/1摩尔比下，NAAPD/GO水凝胶体系能稳定形成，管内倒置时不流动；还发现该体系的最小凝胶浓度为4.0%(w/v)。以氯硝柳胺衍生物(NMD)为控释剂，考察了该控释体系的释药性能；为了考察载药量，将不同质量的NMD以1/1的摩尔比加入1ml的NAAPD/GO水凝胶(THF/H2O=1：1)中。然后，在室温下超声处理6h。通过观察水凝胶的形成，研究了这种超分子水凝胶材料的最大载药量。通过体外释放试验，从96孔玻璃板中取出300μL的溶液，在不同的释放时间(依次为1h、2h、5h、24h、200h)。在锥形瓶中从水面采集日本血吸虫尾蚴，在强光照射下浸泡2h，在不同的释放时间，将感染的日本血吸虫尾蚴从孔中取出，每隔30min用生物显微镜观察尾蚴活性。

4 结果与讨论

4.1 NAAPD、GO和NMD的化学式

图1 N，N-天冬氨酸-3，4，9，10-四羧酸二亚胺(NAAPD)、氧化石墨烯(GO)和氯硝柳胺衍生物(NMD)的化学结构

众所周知，化学式是对化合物性质的初步认识。NAAPD、GO和NMD的化学式如图1所示，NAAPD的结构中心是一个大的苝烯，左右两个天冬氨酸残基。由于石墨烯基部和边缘含氧基团的存在，GO在水和极性有机溶剂中具有高度分散性。花烯被吸引到具有多个苯环结构和GO结构的m-m堆积键上，NAAPD具有良好的生物相容性和亲水性，可以通过氢键参与凝胶化过程。通过试验，利用普通试管，在复合溶液(THF/H2O=1/1)中测定了化合物NAAPD和GO的凝胶能力。

4.2 NAAPD/GO水凝胶的表征

水凝胶的照片如图2a所示。为了深入研究水凝胶的性质，我们将水凝胶冷冻干燥，然后通过扫描电镜观察。发现该水凝胶具有三维网络结构，并与层状结构交联，图2b显示了该水凝胶具有良好的载药性能与空间结构，能够承载添加的药物。

图2 (a)水凝胶的照片；(b)NAAPD/GO样品的SEM图像；(c)NAAPD/GO的AFM图像及其厚度直方图

原子力显微镜(AFM)是表面形貌领域的一种重要仪器，利用热解石墨HOPG原子力显微镜研究了NAAPD/GO的显微结构。NAAPD/GO的AFM图像及其厚度直方图如图2c所示，NAAPD/GO呈层状结构，平均表面粗糙度为0.9nm。其结构与凝胶的层状结构SEM图像一致，NAAPD强烈地被排列有序的GO表面所吸引，水凝胶作为药物载体材料具有优良的力学性能。结果表明，GO和NAAPD在一定的厚度范围内形成了稳定的结构。

红外光谱是研究水凝胶分子间作用力的一种非常有效的方法。为了进一步了解水凝胶的性质，对冻干水凝胶进行了红外分析。图3a中的酰胺基形成氢键，其吸收峰从3458cm-1移动到3428cm-1。酰胺基形成氢键是NAAPD和GO自组装水凝胶形成的主要驱动力，使NAAPD与GO交联形成三维层状结构。

X射线衍射(XRD)是利用X射线衍射分析粉末材料的衍射图样，获得材料成分、材料内部原子或分子的结构或形态等信息的研究方法。图3b中加入NAAPD后在10度之间有两个较强的吸收峰，说明水凝胶排列有序。水凝胶是由有序排列的m-m堆积作用形成的，这说明水凝胶在药物载体材料方面具有良好的性能。

图3 (a)2400-3900 cm-1之间的红外吸收光谱，代表N-H拉伸带的变化；(b)GO和NAAPD/GO干凝胶的X射线衍射图谱；(c)浓度为4.0%(w/v)的NAAPD/GO水凝胶的应变扫描；(d)浓度为4.0%(w/v)的NAAPD/GO水凝胶的动态储能模量(G′)和损耗模量(G″)的频率依赖性浓度。

力学性能是衡量水凝胶性质的重要物理量，通常用流变仪测量，如水凝胶的线性粘弹性应变扫描响应所示(图3c)，在6.28 rad s-1下，在0.1Pa到100Pa的振幅下，储能模量G′保持在大于损耗模量G″的状态，这表明水凝胶是一种粘弹性材料，图3d为水凝胶在4.0%(w/v)浓度下的动态储能模量和损耗模量的频率依赖关系。所有的G′都在G″以上，两者之间的差异基本上没有变化，这表明该水凝胶具有良好的稳定性。G′随频率的增加而略有下降，表明该水凝胶对外部剪切具有良好的耐受性。这些研究证实了NAAPD/GO形成的是稳定的水凝胶，并显示出优良的力学性能，该水凝胶可作为药物载体材料用于药物释放。

4.3 NAAPD/GO/NMD水凝胶的表征

作为一种新型载药材料，水凝胶呈现出令人惊讶的三维网状层状结构。在此基础上，自发地对水凝胶进行了载药性能的测试。在不破坏凝胶形成的情况下，1mL NAAPD/GO水凝胶(4%w/v)在1/1摩尔比下可达到600mg最大载药量，如图4a所示。如图4b所示，与未载药水凝胶相比，载药水凝胶具有更致密的三维网络结构，是一种稳定的结构。结果表明，药物在水凝胶材料表面有较强的吸附。

图4 (a)NAAPD/GO水凝胶的照片；(b)样品的扫描电镜图像；(c)NAAPD/GO水凝胶在4.0%(w/v)浓度下的应变扫描；(d)NAAPD/GO水凝胶在0.1%应变下的频率扫描。

流变仪还测量了超分子载药水凝胶的力学性能。储能模量曲线高于损耗模量曲线，但随着应力的增大而突然减弱，表明水凝胶的三维网络结构已失去交联(图4c)。如图4d所示，储能模量大于损耗模量，两条曲线始终保持直线趋势，说明载药水凝胶具有良好的弹性和稳定性。这意味着水凝胶在给药后仍具有良好的力学性能，是一种优良的药物载体。

4.4 药物释放研究

水凝胶在药物传递领域取得了许多优异的成果。研究中，在NAAPD/GO水凝胶体系中，水凝胶的最大负载量达到了600mg。在500μL水和500μL四氢呋喃(THF)溶液中加入20mg NAAPD和20mg GO。这是NMD在326.5nm处紫外可见分光光度计的标准曲线匹配图(图5a)。用于药物释放实验中NMD浓度的计算。在图5b中，水凝胶的药物释放在前10天的破裂速率快速增加，表明载体水凝胶能够在水中释放药物，达到治疗血吸虫病的效果。在Li等人的基础上进行了抗药性实验，明确表明尾蚴在半小时内NMD释放量达10%以上。药物释放率随时间逐渐降低，64天后达到最大值。因此，该水凝胶的释药性能可维持60天，并在早期具有快速释药性能。

图5 (a)氯硝柳胺衍生物在326.5nm处紫外吸收标准曲线；(b)载药后NAAPD/GO水凝胶在25℃水中的累积释放

所有实验至少分三次进行。

图6 NAAPD/GO/NMD水凝胶缓释水溶液抗尾蚴实验(25℃)的日本血吸虫尾蚴死亡率

对该药物缓释系统体外抗尾蚴能力进行了实验研究。从图6可以看出，96孔玻璃板在1小时的死亡率为7.5%，3小时后死亡率达到92.5%，甚至2小时释放水的死亡率也可以达到100%。可见，NAAPD/GO/NMD水凝胶体系对水体表面具有良好的抗尾蚴活性。

5 结论

低分子水凝胶具有良好的高响应性和可修饰性，在生物医学领域有着广泛的应用。同时，低分子水凝胶由于力学性能差而表现出不稳定性，这一问题成为低分子水凝胶发展的关键。

本文设计了一种力学性能优良的双组分水凝胶(NAAPD/GO)用于在水溶液中的药物释放，水凝胶的主要驱动力是氢键和m-T堆积相互作用，NAAPD的-COOH与GO表面含氧官能团形成氢键。通过NAAPD与GO分子间交联，水凝胶呈现出三维网状结构和层状结构。发现该水凝胶具有良好的机械强度和较大的抗血吸虫病药物载药量，水凝胶流变数值达到104Pa，超过了我们所知的正常低分子水凝胶流变数值(103Pa)。在1ml水凝胶体系中(20mg NAAPD/20mg GO)，水凝胶载药量可达600mg。通过抗尾蚴试验，NAAPD/GO/NMD水凝胶能持续快速杀灭水中尾蚴，释放时间超过2个月。

这项工作为不同需求的尾蚴防治提供了更大的可能性，药物分子设计有望成为材料领域的新方向。