不同林龄华北落叶松根际与非根际土壤酶和土壤微生物研究

郭辉，唐卫平

1. 四川美术学院建筑与环境艺术学院，重庆 401331；2. 重庆大学建筑城规学院，重庆 400030；3. 河南省林业调查规划院，河南 郑州 450045

作为地球化学循环过程中的重要参与者，土壤微生物参与土壤中有机质分解、元素循环和土壤矿化等化学活动，能够促进土壤物质循环，稳定与保持土壤的生产力和健康（石柯等，2019）。微生物的多样性是增强微生物功能和生态系统稳定性的重要因素（亓琳等，2017；于德良等，2019）。作为直接受植物根系和分泌物影响的土壤区域，根际土壤为土壤微生物与植物相互作用提供了场所（黄娜等，2019），使微生物与根系之间保持了适应性协同进化和互惠的关系（鲍勇等，2018；胡留杰等，2018；徐忠山等，2018）。在植物根系活动的影响下，根际土壤的养分含量及其他土壤理化性质发生了变化，进一步使根际微生物群落的组成发生改变，非根际与根际土微生物群落组成和多样性也出现了很大的差异。植物生长需要根际微生物的参与和作用，土壤营养物质能够被促植物生长细菌（PGPR）的代谢活动进行分解、转化，成为植物可吸收利用的形态后被吸收，有效地促进了植物的生长，而一些细菌分泌的激素能够提高植物的适应性（孙英杰等，2018；张守都等，2019）。植物的种类、健康状况、生长阶段等因素会影响根际土壤微生物的群落结构。另外，如土壤营养状况、pH、温度和水分等土壤理化性质会对微生物群落产生较大影响。

土壤微生物作为绝大多数陆生植物生长的载体，其肥力和活性不仅受到土壤养分和水分的影响，同时也受到外界环境的调控作用，不同的微生物种群具有不同的降解和分解速率，其活性和新陈代谢也发生较大的差异，腐殖质和有机质的分解离不开其分解作用，从而将有机质等转化为能够被土壤植被利用的土壤养分，进而维持植株生长发育（Ma et al.，2016）。作为土壤生态的重要一环，微生物的新陈代谢等活动直接决定着土壤物质和能量交换及循环，维持着整个土壤养分的动态转换及循环，常常被作为土壤肥力的体现指标之一（Xue et al.，2006）。一旦生态环境发生较明显的改变，其中的环境因子则会随之发生相应的变化，土壤微生物亦是如此，在土壤生态不断变化的过程中微生物活动也随之改变，不仅微生物能够通过分解和转换有机质等维持土壤养分循环，同时土壤养分也反作用于微生物。由于研究手段和方法有限，多数研究侧重于微生物量的研究（周恒等，2019），而近年来其多样性研究也不断加深，这主要得益于生物分析技术的进步，不仅从物种方面开展相应研究，更从其功能及遗传方面的多样性开展一系列探究，从而更加丰富了微生物多样性研究。

本研究以华北落叶松Larix principis-rupprechtii人工林为对象，通过分析目前林地内不同林分密度落叶松人工林的生长状况，同时分析土壤养分的差异变化，了解华北落叶松人工林土壤微生物群落结构及多样性变化特征，并探讨了其与土壤养分、土壤微生物数量和土壤酶活性之间的关系，为华北落叶松人工林可持续经营和维持该地区土壤肥力提供科学依据，以期实现更大的效益和价值。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于河北省围场县境内的木兰国营林场（116°32′—118°14′E，41°35′—42°40′N），该区南临京津地区，北接内蒙古浑善达克沙地，属于中温带向寒温带过渡、半干旱向半湿润过渡的山地气候，具有水热同季、冬长夏短、四季分明、昼夜温差大的特征，年均气温−1.4—4.7 ℃，最高气温38.9 ℃，最低气温−42.9 ℃，年均降水量380—560 mm，主要集中在7—9月，平均日照为2832 h。灾害天气主要有暴雨、冰雹、沙暴等。林场内土壤有棕壤、褐土、风砂土、草甸土、沼泽土、灰色森林土和黑土7类，分为7个植被类型53个群系，有维管植物科382属693种。主要乔木有华北落叶松、云杉Picea asperata、白桦Betula platyphylla等；主要灌木有山杏Prunus sibirica、绣线菊Spiraea salicifolia、照山白Manchurianrhododendron等；主要草本植物有羊胡子草（Eriophorum）、披碱草Elymus dahuricus等。

1.2 试验设计

1.2.1 样地设置

分别在2016—2018年选取林场内6块华北落叶松人工林样地，每块调查样地大小为30 m×30 m，对样地进行调查，测量胸径、树高、枝下高和冠幅。采用“S”型采样法采集土壤样品，每块样地设置5个样点，每个样点采集5个重复，用土钻采取0—20 cm土层的土样，采集150个土样，3年共采集450个土壤样品。放入铝盒内保存带回实验室，将土样中的杂质去除，自然风干、研磨、过筛后，放入封口袋保存，用于后期土壤养分的分析测定。

1.2.2 土壤样品的测定

根际土壤采用“抖落法”，首先在各样方取出1 kg土壤，取样深度最大为20 cm，将土样混匀后带回实验室，风干，待测。使用元素分析仪对全氮含量进行分析测定；分别采用比色法、光度计法对速效磷、钾含量进行分析；分别采用滴定法、平板梯度稀释法和比色法测定土壤脱氢酶、过氧化氢酶及脲酶；采用重铬酸钾外加热法测定有机碳；pH采用pH计测定；采用钼锑抗比色法测定有效磷。

1.2.3 土壤微生物群落功能多样性

多样性分析所用数据需要在Biolog-Eco下进行72 h的温育处理，之后将等同于10 g烘干土壤的土样加入 NaCl溶液，要求浓度为 0.145 mol·L−1，振荡30 min，然后将其中的100 μL接种于Eco板后读数，恒温培养要求在 25 ℃下进行 216 h，并隔12 h一次读数；之后，在NaCl溶液中进行稀释后进行恒温培养，并做好吸光值记录。

通过分析其对碳源的反应情况来探究微生物对碳源的利用水平，在研究中常用平均每孔颜色变化率 AWCD来表示，该值越大说明其具有较高的微生物丰度，计算式如下（贺文员等，2019）：

式中，Ci、R分别表示第i孔、对照孔的吸光值。

式中，Pi为第i孔的相对吸光值比值，计算公式：

1.3 数据分析

运用Excel 2007和SPSS 18.0进行数据统计和方差检验，以平均值（2016—2018）±标准误差（Mean±SE）表示。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行差异显著性分析，Pearson相关系数法检验各指标之间的相关性，所有原始数据进行对数转换；变量的显著性经过蒙特卡洛（Monte Carlo）检验（499次），CANOCO 4.5继续排序分析。

2 结果与分析

2.1 不同林龄华北落叶松根际与非根际土壤理化性质

从表1可知，华北落叶松根际和非根际土壤pH随着林龄增加呈先降低后增加趋势，在成熟林达到最小；不同林龄华北落叶松根际土壤pH显著低于非根际（P＜0.05），说明由于根在土壤中长期生长，过程中不断向根际分泌出有机化合物，华北落叶松林的土壤pH处于弱酸性，属较强酸性土壤，随着林龄的增大，pH也逐渐增加。华北落叶松根际和非根际土壤有机碳随着林龄增加呈增加后降低趋势，在成熟林达到最大；幼林、中林和成熟林根际土壤有机碳显著高于非根际（P＜0.05），而过熟林根际土壤有机碳与非根际差异不显著（P＞0.05）。华北落叶松根际和非根际土壤全氮随着林龄增加呈增加后降低趋势，在成熟林达到最大；幼林、中林和成熟林根际土壤全氮显著高于非根际（P＜0.05），而过熟林根际土壤全氮与非根际差异不显著（P＞0.05）。华北落叶松根际和非根际土壤全磷随着林龄增加呈增加后降低趋势，在成熟林达到最大；不同林龄华北落叶松根际土壤全磷与非根际差异均不显著（P＞0.05）。华北落叶松根际和非根际土壤有效磷随着林龄增加呈增加后降低趋势，在成熟林达到最大；幼林、中林和成熟林根际土壤有效磷显著高于非根际（P＜0.05），而过熟林根际土壤有效磷与非根际差异不显著（P＞0.05）。

2.2 不同林龄华北落叶松根际与非根际土壤酶活性

由表2可知，华北落叶松根际和非根际土壤酶活性随着林龄增加呈先增加后降低趋势，在成熟林达到最大。其中华北落叶松根际和非根际土壤脲酶活性、蔗糖酶活性、过氧化氢酶活性和碱性磷酸酶活性随着林龄增加呈增加后降低趋势，在成熟林达到最大；幼林、中林和成熟林根际土壤显著高于非根际（P＜0.05），而过熟林根际与非根际差异不显著（P＞0.05）。

2.3 华北落叶松人工林土壤微生物数量

由表3可知，华北落叶松根际和非根际土壤微生物数量随着林龄增加呈先增加后降低趋势，在成熟林达到最大。其中华北落叶松根际和非根际土壤细菌数目、真菌数目、放线菌数目和微生物总数随着林龄增加呈增加后降低趋势，在成熟林达到最大；幼林、中林和成熟林根际土壤显著高于非根际（P＜0.05），而过熟林根际与非根际差异不显著（P＞0.05）。

表1 不同林龄华北落叶松根际与非根际土壤养分Table 1 Soil nutrients in rhizosphere and non-rhizosphere of different ages of Larix principis-rupprechtii

表2 不同林龄华北落叶松根际与非根际土壤酶活性Table 2 Soil enzyme activities in rhizosphere and non-rhizosphere of different ages of Larix principis-rupprechtii

表3 不同林龄华北落叶松根际与非根际土壤微生物数量Table 3 The number of microbes in rhizosphere and non-rhizosphere of different ages of Larix principis-rupprechtii

2.4 华北落叶松人工林土壤微生物群落多样性

由表4可知，华北落叶松根际和非根际土壤微生物多样性指数随着林龄增加呈先增加后降低趋势，在成熟林达到最大。其中华北落叶松根际和非根际物种丰富度指数、均匀度指数和碳源利用指数随着林龄增加呈先增加后降低趋势，在成熟林达到最大；幼林、中林和成熟林根际丰富度指数、均匀度指数和碳源利用指数显著高于非根际（P＜0.05），而过熟林根际与非根际差异不显著（P＞0.05）。不同林龄根际与非根际优势度指数差异不显著（P＞0.05）。

2.5 土壤养分与微生物多样性之间相关性

相关性分析结果表明（表 5），土壤微生物群落多样性与土壤pH之间存在负相关关系，与土壤养分（除了全磷）均呈正相关关系，其中物种丰富度指数（H）、均匀度指数（E）和碳源利用指数（S）与土壤 pH呈极显著负相关（P＜0.01），与土壤养分（除了全磷）均呈显著或极显著正相关关系；优势度指数（Ds）与土壤养分相关性不显著（P＞0.05）；而土壤有机碳和全氮的相关系数最大，说明土壤养分对土壤微生物群落多样性的贡献较大。

由表6可知，土壤微生物群落多样性与土壤微生物数目（除了放线菌数目）均呈正相关关系，其中物种丰富度指数（H）、均匀度指数（E）和碳源利用指数（S）与土壤微生物数目（除了放线菌数目）均呈显著正相关关系（P＜0.05）；优势度指数（Ds）与土壤微生物数目相关性不显著（P＞0.05）。土壤微生物群落多样性与土壤酶活性（除了蔗糖酶）均呈正相关关系，其中物种丰富度指数（H）、均匀度指数（E）和碳源利用指数（S）与土壤酶活性（除了蔗糖酶）均呈显著正相关关系（P＜0.05）；优势度指数（Ds）与土壤酶活性相关性不显著（P＞0.05）。由此可知，土壤养分和微生物数量与微生物群落功能多样性密切相关，其中土壤pH对土壤微生物群落功能多样性贡献为负，土壤养分对土壤微生物群落功能多样性贡献为正，这是造成土壤微生物群落多样性季节性差异的重要原因。

表4 不同林龄华北落叶松根际与非根际土壤微生物群落多样性Table 4 Soil microbial community diversity in rhizosphere and non-rhizosphere of different ages of Larix principis-rupprechtii

表5 土壤养分与微生物多样性之间相关性Table 5 Correlation between soil nutrient and microbial diversity

表6 土壤微生物数目和酶活性与微生物多样性之间相关性Table 6 Correlation among the number of microbe，enzymatic activities and microbial diversity

2.6 土壤微生物群落的RDA分析

蒙特卡罗置换检验结果显示，第一典范轴P＜0.05，表明该排序模型的解释变量（即土壤环境因子）与响应变量（即土壤细菌和真菌群落结构）的变化关系较显著。华北落叶松根际土壤细菌和真菌群落与土壤环境因子的冗余分析结果见图 1。对于根际，RDA前两个排序轴的特征值分别为 0.63和0.19，分别解释了63%和19%的细菌多样性变化。本文所选的土壤环境因子共解释了 82%的总特征值，对华北落叶松根际土壤细菌群落有显著影响。其中对土壤细菌多样性影响较大的有SOC和TN，而pH对土壤细菌多样性影响为负。对于非根际，RDA前两个排序轴的特征值分别为0.59和0.28，分别解释了59%和28%的微生物多样性变化。本文所选的土壤环境因子共解释了87%的总特征值，对华北落叶松根际土壤真菌多样性有显著影响。其中对土壤真菌多样性影响较大的有SOC和TN，而pH对土壤真菌多样性影响为负。

3 讨论

图1 土壤根际和非根际土壤微生物多样性与环境因子的关系Fig. 1 Relationship between soil microbial diversity and environmental factors in rhizosphere and non-rhizosphere soils

土壤微生物群落对碳源的利用能力也会出现较大差异，这主要是其群落分布数量及功能等方面存在较大差异，在微生物研究过程中常常使用丰度及多样性指数开展相应的研究（魏枫等，2019）。Shannon指数基于颜色变化率的基础上开展微生物对碳源的利用能力，主要侧重于功能方面，该指数越大的情况下则说明微生物能够利用更多种类的碳源、且利用效率更高，该指标是一种正向的表示（Gao et al.，2010；Stark et al.，2008）；Mc-Intosh指数主要是对物种均一分布特性方面的研究，当微生物对碳源利用量更大、利用种类更多的情况下，该指数也越大，这也是一种正向的表示（余薇薇等，2018）。Simpson指数更多地反映的是碳源嗜好。均匀度指数能够在多样性指数的基础上通过计算而得，这主要受到两个方面的影响：第一，微生物分布的种类，也就是我们常说的丰度；第二，该微生物分布是否呈现均匀分布，微生物的种类越多，也就意味着其具有更明显的多样性，其分布更均匀的情况下能够增加其分布数量，也就是提升了多样性。本研究中，华北落叶松根际和非根际物种丰富度指数（H）、均匀度指数（E）、优势度指数（Ds）和碳源利用丰富度指数（S）随着林龄增加呈先增加后降低趋势，在成熟林达到最大，幼林、中林和成熟林根际显著高于非根际（P＜0.05），而过熟林根际与非根际差异不显著（P＞0.05）。主要原因在于成熟林根系生长旺盛，分泌较多根系分泌物，对于促进生物量增长作用明显，加之养分富集效应，形成了更高水平的根系养分含量（张宇冲等，2019）。此外，其在降尘物质的作用下及腐殖质影响下，根际沉积更为明显，这对于微生物活动也起着积极作用，能够促进微生物生长发育，进而加快有机质分解和降解，对于养分的转化起着积极作用，因此形成更高的养分含量（梁晋刚等，2019；刘福春，2019）。对于土壤pH值，华北落叶松根际和非根际土壤pH随着林龄增加呈先降低后增加趋势，在成熟林达到最小，不同林龄华北落叶松根际土壤 pH显著低于非根际（P＜0.05）；说明由于根在土壤中长期生长，过程中不断向根际分泌出有机化合物，华北落叶松林的土壤 pH处于弱酸性，属较强酸性土壤，随着林龄的增大，pH也逐渐增加。

华北落叶松根际和非根际土壤蔗糖酶活性、碱性磷酸酶活性、脲酶活性和过氧化氢酶活性随着林龄增加呈先增加后降低趋势，在成熟林达到最大，幼林、中林和成熟林根际显著高于非根际（P＜0.05），而过熟林根际与非根际差异不显著（P＞0.05），这反映了根际聚集效应，表明土壤中的有效钾、有效磷含量较高。但是对于幼龄华北落叶松来说，其根系并未发育完善，根产物较少，所以主要通过腐殖质分解获得有机质；对于中龄林和成熟林来说，可以通过根产物收获大量的有机质。随着华北落叶松林龄的增加，土壤酶活性会呈现“低-高-低”的状态，先降后升，于中龄时达到最高点后再开始下降。研究显示，根际酶活性远远高于非根际酶活性（Asadishad et al.，2018），华北落叶松根系分泌的酶进入土壤会形成极强的酶活性。在微生物作用下，根际的作用范围缩小，微生物分布数量及养分在外界环境变化的情况下，会改变内部结构，直接影响酶的分泌，导致不同土壤区域的酶活性出现较大差异。

土壤微生物能够将腐殖质等有机质进行分解及降解，从而使之能够转化为土壤养分以供植物吸收利用，形成土壤养分，从而明显改善土壤肥力，同时对土壤理化特性起着改善作用，进而为植被生长提供更加良好的土壤条件，促进植被生长发育，同时利于微生物活动，增强微生物的群落分布丰度和均匀度（Li et al.，2015）；另一方面，微生物活动也需要必要的养分以维持其新陈代谢等活动，该部分养分主要来源于土壤，因此二者关系密切（Knelman et al.，2015；Crecchio et al.，2004）。土壤养分和微生物数量与微生物群落功能多样性密切相关，其中土壤pH对土壤微生物群落功能多样性贡献为负，土壤养分对土壤微生物群落功能多样性贡献为正，这是造成土壤微生物群落多样性季节性差异的重要原因。

4 结论

华北落叶松根际和非根际土壤pH随着林龄增加呈先降低后增加趋势，而土壤有机碳、全氮和有效磷随着林龄增加呈先增加后降低趋势，在成熟林达到最大；华北落叶松根际和非根际土壤细菌数目、真菌数目、放线菌数目、微生物总数、土壤蔗糖酶活性、碱性磷酸酶活性、脲酶活性和过氧化氢酶活性随着林龄增加呈先增加后降低趋势，在成熟林达到最大。土壤养分、土壤微生物数量和土壤酶活性均与土壤微生物群落多样性具有显著的相关性，其中，土壤养分对微生物群落多样性的贡献最大（其相关系数绝对值最大）。冗余分析表明土壤微生物群落多样性与土壤养分含量均呈正相关（除了 pH），全碳和全氮与丰富度指数相关性最大，由此可知，有机碳和全氮是影响该区土壤微生物群落多样性分布的主要因子。综合来看，除了pH之外，土壤养分对微生物分布产生多方面的制约作用，且是正向的影响作用，其中全碳及全氮的影响最大，这也是不同的土壤类型其微生物分布也存在显著差异的原因之一。土壤环境因子能够显著影响微生物分布，不同的植被分布也对微生物活动产生明显的制约作用，土壤环境因子的复杂性使得微生物分布也具有很大的复杂性。