HPLC法同时检测人血浆中霉酚酸及其两种代谢产物的浓度

周金金，范国荣，3*

[1.广西中医药大学药学院，南宁 530200；2.上海交通大学附属第一人民医院临床药学科，上海200080；3.海军军医大学药学院药物分析学教研室，上海市药物(中药)代谢产物研究重点实验室，上海 200433]

霉酚酸(mycophenolic acid，MPA)是临床常用免疫抑制剂吗替麦考酚酯的活性代谢产物，因其肝毒性、肾毒性低，耐受性好，已被广泛应用于肾、肝或其他组织器官移植后的排异反应和某些自身免疫性疾病的治疗[1]。有研究表明， MPA的药动学和药效学存在极大的个体差异，浓度与疗效之间个体差异很大，浓度与药品不良反应(ADRs)之间也有相关性[2]。而通过治疗药物监测(therapeutic drug monitoring,TDM)调整用药剂量，实现个体化精准用药，可以进一步优化MPA的使用，较好地改善患者预后。

MPA的代谢产物主要为霉酚酸葡萄糖苷(7-O-mycophenolic acid-glucuronide,MPAG)和酰基霉酚酸葡萄糖苷(acyl-mycophenolic acid-glucuronide，AcMPAG)。有研究表明，MPAG本身无药理活性，但在短暂的肝肠循环作用下重新形成MPA，使MPA暴露量增加，导致毒性反应的发生[3-4]；另一代谢产物AcMPAG在体内堆积过多时也会引发血液疾病、胃肠道功能紊乱、感染等ADRs[5]。代谢产物的血药浓度与ADRs的关系备受关注，因此，同时检测MPA的代谢产物MPAG、AcMPAG的浓度，评价相关ADRs很重要。目前已有的检测方法有酶放大免疫(enzyme-multiplied immunoassay technique,EMIT)法[6]、HPLC法[7]、LC-MS/MS法[8]和毛细管电泳法[9]等，但关注点往往集中在霉酚酸或者一种代谢产物上。本研究以艾司唑仑为内标，建立了能同时测定人血浆中MPA、MPAG、AcMPAG的HPLC法，并应用于患者血药浓度监测，为临床合理使用吗替麦考酚酯等药物提供参考。

1 材 料

1.1 仪器 Ultimate 3000高效液相色谱仪(美国Thermo公司，包括U3000-VWD检测器和Chromeleon工作站)；HY-5涡旋混合器(美国SI公司)；Centrifuge 5804 R冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；FE20型实验室pH计(瑞士Mettler Toledo公司)；CPA225D十万分之一电子分析天平(德国赛多利斯公司)；SK7200H超声仪(上海科导超声仪器有限公司)；Hi-Tech水纯化系统(上海和泰仪器有限公司)。

1.2 试剂 MPA对照品(纯度98%，批号24280-93-1，上海安谱实验科技有限公司)；MPAG(纯度98.36%，批号31528-44-6)、AcMPAG对照品(纯度95%，批号99043-04-6，加拿大Toronto Research Chemicals公司)；艾司唑仑对照品(纯度98%，批号171219-0102，大连美仑生物技术有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国Merck公司)；偏磷酸(HPO3,分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；磷酸二氢钠(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)。空白血浆采自上海交通大学附属第一人民医院的健康志愿者。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Welch Xtimate C8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相为甲醇(A)-10 mmol/l NaH2PO4(pH 3.0)水溶液(B)，梯度洗脱：0～15 min，46%～30% B，15～20 min，30%～40% B。流速为1.0 ml/min，检测波长215 nm，柱温40 ℃，进样量20 μl。

2.2 对照品溶液与工作液的配制 精密称取MPA、MPAG、AcMPAG、艾司唑仑对照品，用甲醇溶解、稀释并定容，得到浓度分别为1.00、2.50、1.00、1.00 mg/ml的储备液，于-20 ℃保存备用。将上述储备液用50%甲醇逐级稀释得到工作液。工作液中MPA、AcMPAG浓度均为1.96、3.91、7.82、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00 μg/ml，MPAG浓度为3.91、7.82、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 μg/ml，于-20 ℃保存备用。另配制MPA、AcMPAG浓度均为2.50、25.00、200.00 μg/ml及MPAG浓度为5.00、50.00、400.00 μg/ml的低、中、高浓度混合质控工作液，于-20 ℃保存备用。艾司唑仑内标溶液的浓度为20.00 μg/ml，于-20 ℃保存备用。

2.3 血浆样品前处理 精密吸取10 μl工作液，置于1.5 ml Eppendorf管中，加入90 μl空白血浆，再加入10 μl浓度为20 μg/ml的内标溶液，涡旋振荡30 s，加入50 μl 10% 偏磷酸后混匀，再加入50 μl乙腈进行蛋白沉淀，涡旋振荡1 min，以2.081 7×g离心5 min(4 ℃)，取上清进样分析，进样体积20 μl。

2.4 专属性实验 取6份不同来源的空白血浆，按2.3项下方法进行样品前处理，按2.1项下色谱条件进行检测，观察色谱图的出峰情况，考察内源性物质及其他物质是否对待测物有干扰。结果在本研究条件下，MPAG、AcMPAG、内标艾司唑仑及MPA的出峰时间分别为4.623、6.627、9.007和10.977 min，血浆中的内源性物质对测定无干扰，联用药物如他克莫司、泼尼松对MPA、MPAG、AcMPAG及内标的测定无干扰，见图1。

2.5 标准曲线的绘制 取10 μl 2.2项下混合工作液，加入90 μl空白血浆中，配制成MPA、AcMPAG浓度为0.196、0.391、0.782、1.563、3.125、6.25、12.5、25.0 μg/ml和MPAG浓度为0.391、0.782、1.563、3.125、6.25、12.5、25.0、50.0 μg/ml的标准曲线样品，按2.3项下方法操作后进样分析，记录峰面积。以待测样品峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标(Y)，浓度为横坐标(X)进行线性回归。结果MPA和AcMPAG的线性范围为0.19～25.0 μg/ml；MPAG的线性范围为0.39～50.0 μg/ml。MPA的标准曲线方程为Y1=0.519 4X1+0.049，r=0.999 1；MPAG的标准曲线方程为Y2=0.455 5X2+0.503，r=0.999 4；AcMPAG的标准曲线方程为Y3=0.272 2X3+0.006 4，r=0.999 8，表明线性关系良好。

2.6 检测限与定量下限实验 将工作液用50%甲醇多次稀释后，按2.3项下方法进行样品前处理，再进样检测，得到S/N>3的浓度，将S/N>3的浓度定义为检测限浓度(LOD)；将标准曲线工作液最低浓度定义为定量下限浓度(LLOQ)。 结果MPA、AcMPAG的检测限为0.048 μg/ml，MPAG的检测限为0.097 μg/ml；MPA、AcMPAG的定量下限为0.19 μg/ml，MPAG的定量下限为0.39 μg/ml。

2.7 精密度和准确度实验 用空白血浆配制MPA、AcMPAG浓度均为0.25、2.5、20.0 μg/ml和MPAG浓度为0.5、5.0、40.0 μg/ml的质控样品，每个浓度5份样品，按2.3项下方法处理后进样测定。每天测定一次，连续测定3 d，记录峰面积，计算批间和批内精密度与准确度，分别用RSD、RE表示。结果日内、日间精密度RSD均<15%，准确度RE均在85%～110%，见表1。

2.8 提取回收率实验 取2.7项下配制的低、中、髙浓度的质控样品，按2.3项下方法处理后进行测定。配制相同浓度的不含生物基质的对照品溶液进行测定，比较峰面积，计算提取回收率。结果MPA、MPAG、AcMPAG和内标艾司唑仑的提取回收率分别为92.50%～105.12%、90.58%～104.82%、86.37%～103.57%、98.11%～101.64%，RSD均<15%(n=5)。

图1 人血浆中霉酚酸及其代谢产物的HPLC谱图A：空白血浆；B：空白血浆+霉酚酸(MPA)+霉酚酸葡萄糖苷(MPAG)+酰基霉酚酸葡萄糖苷(AcMPAG)+ 内标艾司唑仑(浓度分别为25.0、50.0、25.0、20.0 μg/ml)；C：患者血浆样品；D：空白血浆+他克莫司(25.0 μg/ml)； E：空白血浆+泼尼松(25.0 μg/ml)；1：MPAG；2：AcMPAG；3：内标艾司唑仑；4：MPA

表1 血浆中MPA、MPAG、AcMPAG的 精密度和准确度实验结果 (n=5)

2.9 稳定性实验 配制同2.7项下低、中、髙浓度的质控样品，于室温放置6 h、进样盘放置6 h、反复冻融3次、密封低温(-40 ℃)保存1个月，按2.3项下方法处理后进样测定，考察不同条件下样品的稳定性。结果样品在上述条件下均保持稳定。

2.10 临床患者血药浓度监测 国内外均推荐MPA治疗谷浓度为1.0～3.5 μg/ml[10]。但因存在个体差异、药物相互作用等影响因素，MPA谷浓度暴露量与推荐治疗窗有差异，因此应对MPA进行治疗药物监测。

本研究收集2017-2018年上海交通大学附属第一人民医院肾移植术后复查的门诊患者28例，均长期服用麦考酚钠肠溶片或吗替麦考酚酯胶囊和其他免疫抑制剂。抽取患者谷浓度血样，检测MPA血药浓度和生化指标。结果MPA血药浓度在0.154～6.65 μg/ml范围，见表2。其中有16例患者MPA谷浓度不在1.0～3.5 μg/ml范围内，与推荐治疗范围有差异，但患者肝、肾功能指标均在正常范围，身体机能处于稳定状态，未发生ADRs，因此维持用药剂量不变。考虑到患者由于个体间代谢差异、饮食等因素影响，是否调整用药剂量和用药方案确保机体各指标正常，需继续进行临床TDM。

表2 28例肾移植患者霉酚酸血药浓度分布范围

3 讨 论

3.1 色谱条件的考察 在选择流动相时,本研究考察了5、10、15 mmol/L NaH2PO4对各待测物出峰的影响，并且在酸碱度的选择上，为契合各化合物的性质，使待测物在洗脱过程中稳定存在，不黏附，经优化后最终选择了10 mmol/L NaH2PO4(pH 3.0)作为水相。

本研究参考国内外文献，研究了不同型号色谱柱如Waters Symmetry C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Waters XBridge C18柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)、Welch Xtimate C8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-AQ柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Waters Atlantis T3柱(100 mm×3 mm，3 μm)，发现待测物在填充粒径为5 μm、内径为4.6 mm的色谱柱中出峰结果较好。待测物在250 mm柱长的色谱柱中能更快出峰，从而节省了总的运行时间。代谢产物MPAG、AcMPAG极性较高，含有的基团增加了其亲水性，不同填充材料和不同键合相对色谱分离也有影响。AQ、C18色谱柱和T3色谱柱在洗脱化合物时也能达到分离的目的，但MPA和MPAG、AcMPAG极性相差较大，且调节流动相发现，MPA对水相的变化较敏感，不能同时满足时间短、分离度好的要求，而使用Welch Xtimate C8色谱柱，在40 ℃的柱温、合适的流动相条件下具有较好的分离度，峰型也比较好，在12 min内4种物质均能出峰，满足检测的要求。

本研究在200～600 nm波长扫描后发现，MPA、MPAG、AcMPAG在215、254、305 nm波长下均有紫外吸收，代谢产物MPAG、AcMPAG在215 nm波长下吸收更强。与文献[11]中报道的使用UV检测MPA、AcMAG，荧光检测MPAG，使用双内标的方法相比较，本研究采用215 nm检测波长，灵敏度高，内源性物质无干扰，能同时检测3种待测物及内标。

3.2 样品前处理条件的考察 文献报道的血浆样品前处理方法有固相萃取法[12]、液-液萃取法[13]和蛋白沉淀法[6]。本研究比较这3种样品前处理方法。固相萃取实验中使用的萃取小柱消耗高、成本高；在液-液萃取实验中，本研究考察了不同的有机溶剂乙酸乙酯、叔丁基甲基醚、异丙醇、二甲亚砜对待测物回收率的影响，发现液-液萃取法中待测物的回收率不足40%，且过程耗时长；在蛋白沉淀法实验中，通过对比用硫酸锌、钨酸钠、高氯酸、偏磷酸、乙腈、甲醇对样品进行前处理后发现，同时加入乙腈和10%偏磷酸前处理样品，待测物的回收率>70%，准确性好，且操作简便、快速，能满足检测要求。本研究经过考察，最终选用同时加入乙腈和10%偏磷酸前处理样品的蛋白沉淀法。

3.3 内标的选择 本研究考察了不同的内标如阿立哌唑、苯妥英钠、艾司唑仑、氯丙嗪等，发现艾司唑仑不干扰待测物，响应好，因此选用艾司唑仑作为内标。

本研究建立了一种简便、可靠、能同时检测人血浆中MPA、MPAG、AcMPAG浓度的HPLC法，可用于患者MPA血药浓度监测，为临床合理、安全、有效用药提供技术支持，进一步保障用药安全。