加味二陈汤对非酒精性脂肪性肝病大鼠血清瘦素的影响*

杜 冰，王佳宁，杨 艳，洪 力，闫龙腾，罗德霞，姚 政，4△

（1.云南中医药大学，云南 昆明 650500；2.榆林市教育示范性综合实践基地，陕西 榆林 719000；3.云南省临沧卫生学校，云南 临沧 677000；4.云南省高校中医证候微观辨证重点实验室，云南 昆明 650500）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty live，NAFLD）是全球最普遍的肝脏疾病，患者高达17亿，在中国患病率高达29.2%[1-2]。NAFLD患者易同时存在胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）及代谢综合症，很大程度上增加了肝癌和心血管病的风险[3-4]。瘦素（leptin，LEP）又称瘦蛋白，是人体OB基因编码的一种分泌性蛋白，主要由脂肪细胞合成，释放入血，抑制胰岛素的释放，调控糖脂代谢平衡[5]。当机体摄入高脂高糖食物等因素引起瘦素水平长时间升高后，会引发瘦素抵抗，胰岛素减少，糖脂代谢紊乱，游离脂肪酸通过血液循环进入肝脏，加重了肝脏的负担，引起脂质沉积在肝脏，成为脂肪肝[6-7]。中医学认为，痰瘀互结是NAFLD的主要病因，痰与瘀同源、互化、同病，共碍肝、脾二脏机能[8]。加味二陈汤是在二陈汤的基础上加三七，主要功效为祛瘀化痰，为临床治疗NAFLD的常用方[9-11]。课题组前期研究表明加味二陈汤可通过调节NAFLD大鼠脂质代谢，改善脂肪肝症状[12]。本实验通过复制非酒精性脂肪性肝病大鼠模型，观察加味二陈汤对NAFLD脂质代谢及血清瘦素的影响，寻找加味二陈汤治疗NAFLD的有效作用靶点，进一步明确化痰祛瘀法的现代医学基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级8周龄雄性SD大鼠80只（四川省成都达硕生物有限公司，生产证号：SCXK（川）2014-23，合格证号：0018160），体质量180～220 g。动物饲养于云南中医药大学SPF级动物房，室内保持安静，12 h照明，温湿度适宜，实验期间动物自由饮食饮水。

1.2 药物与试剂 加味二陈汤由陈皮15 g，半夏15 g，茯苓9 g，甘草5 g，三七6 g组成，生药购自云南中医药大学门诊部药房。辛伐他汀片（哈药集团三精制药股份有限公司，批号：1401001）；0.9%NaCl溶液（辰欣药业股份有限公司，批号：1601080726）；大鼠瘦素ELISA检测试剂盒（美国R&D公司，批号：CSB-E07433r）；谷草转氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）检测试剂盒均购自罗氏生物科技有限公司（批号分别为：21595301、01757261、01772862、197344-01）；肝脏甘油三酯检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：AUZ5073）。

1.3 主要仪器 罗氏全自动生化分析仪Cobas c311（德国罗氏）；Spectra Max 340PC酶标仪（美国分子仪器公司）；AR2140电子分析天平（上海奥豪斯公司）；正置光学显微镜ECLIPSE E200（日本Nikon公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 药物制备 中药煎煮方法参考《中药药理实验方法学》（上海科学技术出版社，2006年版），汤药浓缩后加入三七粉，室温冷却，分装，4℃冰箱冷藏保存。灌胃时37℃水浴加热30 min后使用。大鼠用药剂量为成人临床等效剂量，换算方法参考《实验动物学》（中国中医药出版社，2012），用人与大鼠体表面积转换系数换算成大鼠每日所需生药量，灌胃剂量为4.5 g/kg。

辛伐他汀片碾碎研磨后溶解于0.9%NaCl中，分装，4℃冰箱冷藏保存。用药剂量为成人临床等效剂量，换算方法同上，剂量为1.8 mg/kg。

1.4.2 动物分组、药物干预、一般指标观察 将实验动物置于动物房，适应性饲养1周，随机分为4组，分别为正常组、模型组、辛伐他汀组、加味二陈汤组，每组20只。正常组给予普通饲料喂养，其他组给予高脂饲料（88%普通饲料，10%猪油，2%胆固醇）。喂养至第9周开始灌胃，正常组和模型组予以等体积0.9%NaCl灌胃；辛伐他汀组予以辛伐他汀（1.8 mg/kg）灌胃；加味二陈汤组予加味二陈汤（4.5 g/kg）灌胃，每日1次，持续至12周末。期间对大鼠体质量、毛色光泽度、进食、活动度分别进行观察，取材时称量大鼠体质量和肝脏湿重。

1.4.3 血清指标及肝脏甘油三酯检测 分别于10、12周末观察大鼠各项指标。采用生化分析仪检测血清 AST、TG、HDL-C、LDL-C 水平；血清瘦素采用ELISA法检测；肝脏TG采用GPO-PAP法，严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.4 HE染色 各大鼠肝脏大叶距肝门约5 mm处取相同部位大小约10 mm×10 mm×3 mm肝组织1块，4%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，切成4 μm的组织片后进行HE染色，正置光学显微镜下观察。

1.5 统计学分析 使用 SPSS 22.0软件进行统计学处理，数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐时用LSD检验，方差不齐时用Dunnett T3检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况观察 开始实验的前3周各组大鼠状态良好，高脂饮食喂养的3组大鼠在第4周开始食物摄入量明显增加。第10周开始，各组大鼠毛色光泽度下降，饮食、活动度明显降低，其中模型组最为明显。加味二陈汤组出现便粘软，偶有稀溏，可能是药物干预影响了消化功能。

2.2 大鼠肝指数 肝指数可以反应肝脏的受损程度，计算方法：肝指数（%）=肝湿重（g）/体质量（g）×100%。结果显示，与正常组比较，10、12周末模型组肝指数均显著增高（P＜0.05）。10周末与模型组比较，辛伐他汀组明显降低（P＜0.05），加味二陈汤组有降低趋势，但差异无统计学意义。12周末与模型组比较，辛伐他汀组、加味二陈汤组肝指数降低明显（P＜0.05），见表 1。

表1 各组大鼠肝指数比较（±s，n=10）

表1 各组大鼠肝指数比较（±s，n=10）

注：与正常组比较，▲P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

组别剂量/（g·kg-1）10周末/%12周末/%正常组 - 2.53±0.20 2.36±0.33模型组 - 2.98±0.48▲ 3.35±0.62▲辛伐他汀组 0.0018 2.68±1.27* 3.17±0.51*加味二陈汤组 4.5 2.81±0.36 3.16±0.58*

2.3 大鼠肝脏外观 正常组大鼠肝脏体积较小，包膜饱满圆钝，色泽深红；模型组大鼠肝脏体积较正常组增大，色黄，质地略软，表面呈花斑状；辛伐他汀组、加味二陈汤组较模型组均有改善。

图1 大鼠肝脏外观

2.4 大鼠肝组织病理变化 正常组肝细胞结构未见明显异常。模型组10周末肝索排列紊乱，超过2/3的肝细胞胞浆中出现圆形脂滴空泡；12周末胞浆疏松化，几乎完全出现气球样变。辛伐他汀组10周末肝索排列紊乱，部分可见圆形脂滴空泡；12周末圆形脂滴空泡较之前减少。加味二陈汤组10周末肝索排列紊乱，肝细胞胞浆约1/3的视野中可见圆形脂滴空泡；12周末圆形脂滴空泡较之前减少。各药物处理组肝组织损伤情况较模型组有所改善。

2.5 大鼠各项生化指标变化 10周末结果显示，与正常组比较，模型组大鼠血TG、肝TG、LDL-C显著升高，HDL-C 显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，辛伐他汀组大鼠血TG显著降低（P＜0.05），加味二陈汤组 LDL-C 显著降低（P＜0.05），见表2。

表2 10周末各组大鼠生化指标变化（±s，n=10）

表2 10周末各组大鼠生化指标变化（±s，n=10）

注：与正常组比较，▲P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

组别剂量/（g·kg-1）AST/（U·L-1）血TG/（mmol·L-1）肝TG/（mg·g-1）HDL-C/（mmol·L-1）LDL-C/（mmol·L-1）正常组 - 154.29±40.64 0.35±0.07 2.33±0.49 1.16±0.24 0.33±0.29模型组 - 163.13±38.68 0.46±0.09▲ 6.31±2.04▲ 0.99±0.36▲ 1.00±0.26▲辛伐他汀组 0.0018 153.38±11.08 0.39±0.05* 4.89±1.90 0.77±0.12 0.77±0.26加味二陈汤组 4.5 161.63±25.49 0.44±0.05 4.90±1.24 0.73±0.09 0.68±0.24*

12周末结果显示，与正常组比较，模型组大鼠AST、血 TG、肝 TG、LDL-C显著升高，HDL-C显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，辛伐他汀组血TG及加味二陈汤组血TG、肝TG显著降低，而HDL-C均升高（P＜0.05），见表 3。

表3 12周末各组大鼠生化指标变化（±s，n=10）

表3 12周末各组大鼠生化指标变化（±s，n=10）

注：与正常组比较，▲P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

组别剂量/（g·kg-1）AST/（U·L-1）血TG/（mmol·L-1）肝TG/（mg·g-1）HDL-C/（mmol·L-1）LDL-C/（mmol·L-1）正常组 - 157.83±30.27 0.37±0.02 2.48±0.39 0.78±0.13 0.28±0.19模型组 - 217.71±38.76▲ 0.56±0.15▲ 6.13±1.91▲ 0.73±0.11▲ 1.09±0.27▲辛伐他汀组 0.0018 206.50±20.07 0.46±0.07* 5.59±1.15 0.83±0.06* 0.88±0.39加味二陈汤组 4.5 205.63±29.49 0.46±0.08* 3.72±1.19* 0.84±0.12* 0.80±0.21

2.6 大鼠血清瘦素变化情况 与正常组比较，模型组2个时间点的血清瘦素水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，辛伐他汀组和加味二陈汤组血清瘦素水平均显著降低（P＜0.05），其中辛伐他汀组下降最多，接近正常组水平。

表4 各组大鼠血清LEP比较（±s，n=10）

表4 各组大鼠血清LEP比较（±s，n=10）

注：与正常组比较，▲P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

组别 剂量/（g·kg-1）10周末/（ng·mL-1）12周末/（ng·mL-1）正常组 - 2.07±0.43 1.57±0.39模型组 - 3.67±0.53▲ 2.50±0.29▲辛伐他汀组 0.0018 2.21±0.36* 1.69±0.58*加味二陈汤组 4.5 2.71±0.40* 1.80±0.66*

2.7 各组大鼠血清瘦素与血TG、LDL-C、肝TG的相关性分析 结果表明，各组大鼠血清瘦素表达量与血TG、LDL-C、及肝 TG 含量呈正相关（P＜0.05），见表 5。

表5 各组大鼠血清瘦素表达量与血TG、LDL-C、肝TG的相关性分析

3 讨论

中医认为，NAFLD病因多为饮食不节，劳逸失当，病位在肝、脾、肾三脏，病机主要是痰浊与血瘀[13]。痰浊和瘀血既是病因，也是病理产物。脂肪肝的发生发展与痰浊、瘀血密不可分[14]。遵从“方从法出、法随证立”的古训，中医治疗NAFLD的基本治法为化痰祛瘀[15]。经典化痰方二陈汤由陈皮、半夏、茯苓、甘草组成。现代临床和实验研究证实，二陈汤等系列方可以有效改善脂肪肝情况[9，16-17]。加味二陈汤中的加味药三七是云南的道地药材，具有化瘀止血、补血活血、消肿止痛、养血强身等功效，为中医活血化瘀常用药。三七的主要有效成分为三七总皂苷，有抗炎、抗氧化、降血脂及血糖、抗血小板聚集、促进血管新生、扩张血管、改善肝内微循环及脑缺血损伤等作用[18-19]。在二陈汤基础上加三七，可以共奏化痰祛瘀之功。

“瘀”的病理表现之一为肝脂、血脂过多。肝脏中过多的脂质会导致肝细胞脂肪变性，进而引起肝脏损伤。本实验结果显示，加味二陈汤组大鼠肝脏脂质沉积情况较轻，肝指数、血清TG、HDL-C、LDL-C及肝TG均显著降低。本研究中模型组大鼠处于脂肪肝早期，10周末模型组AST有所升高，但无统计学差异，12周末AST显著升高；加味二陈汤灌胃后AST明显低于模型组，说明加味二陈汤能一定程度改善大鼠肝功能。上述结果表明，加味二陈汤可以通过化痰祛瘀有效治疗NAFLD。

瘦素是一种由OB基因编辑的分泌性蛋白，由脂肪细胞释放，能够有效抑制游离脂肪酸在肝脏等非脂肪组织的积聚[20]。在正常机体中，瘦素可以促进脂肪的分解和代谢，在保持体重和体脂方面起重要作用[21]。临床研究证实，NAFLD患者血清瘦素水平升高与IR呈正相关、与糖代谢障碍指标呈正相关，提示血液中瘦素水平与甘油三酯在肝细胞内蓄积，并促进单纯性脂肪肝向脂肪性肝炎的转变中发挥重要作用[5，22]。本实验中，10、12周末大鼠血清瘦素水平结果表明，模型组血清瘦素随造模时间增加而逐渐升高，表明血清瘦素水平在脂肪肝发展过程中不断升高，与肝脏脂肪病变的严重程度相关。相关性分析发现，血清瘦素水平与血脂、肝脂含量呈正相关，提示瘦素在脂代谢紊乱过程中是值得关注的一个重要指标。加味二陈汤治疗后血清瘦素水平明显下降，说明瘦素可能是加味二陈汤治疗NAFLD的有效作用靶点之一。

综上所述，具有化痰祛瘀功效的加味二陈汤可有效降低血脂、肝脂，保护肝功能，同时可通过降低血清瘦素水平改善机体糖脂代谢，对NAFLD起治疗作用，有较好的疗效和安全性。中药复方作用靶点较多，在后期研究中，可考虑对其他糖脂代谢相关指标如JAK/STAT3、AMPK/ACC2等信号通路蛋白进行检测，并结合代谢组学方法，进一步阐明化痰祛瘀法治疗NAFLD的作用机制。