骨质疏松患者外周血差异表达miR-19b调控骨髓间充质干细胞成骨分化的作用机制研究*

彭松林 王尚 陈高扬

（深圳市人民医院脊柱外科，暨南大学第二临床医学院，南方科技大学第一附属医院，广东深圳 518020）

骨质疏松是最为常见的年龄相关性骨科疾病，特点是骨量减少，骨微结构改变，进而导致骨脆性和骨折风险增加[1-3]。当前全球范围内约有2 亿骨质疏松症患者，其中890 万并发骨折症状，严重降低了患者的生活质量并大幅增加死亡风险[4]。骨质疏松症的病因包括女性绝经后状态、年龄增长、性腺功能减退或卵巢早衰、类风湿关节炎、缺钙、吸烟、酗酒和长期使用某些药物（如糖皮质激素、抗凝剂、抗惊厥药、癌症化疗药物等）[5-7]。随着人口老龄化的加剧，骨质疏松症发病率逐年升高，成为当前世界性的难题。骨质疏松症主要由于骨代谢过程中骨形成和骨吸收失衡所致，而骨髓间充质干细胞在骨修复过程中发挥重要作用[2,8,9]。深入了解骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的调控机制，有助于揭示骨代谢过程中新的作用机制和靶点，为骨质疏松症的病理机制提供新的理论依据，为骨质疏松症预防和治疗提供全新的策略和思路。

微小RNA（miRNA）被证实可在转录后通过抑制目标基因调控疾病进展[10-12]，已有研究报道miRNA在骨质疏松中差异表达且发挥重要调控作用[13,14]。然而，miRNA 在骨质疏松性椎体骨折患者外周血中的表达谱变化尚不明确，血浆中差异表达miRNAs在成骨过程中的作用尚不清楚。本研究检测伴有或不伴有椎体骨折的骨质疏松症患者相对于健康对照的miRNA 差异表达谱，通过生物信息学分析筛选出成骨相关miRNA 并进一步通过细胞实验验证其对BMSCs 成骨分化的调控作用。目的是为绝经后骨质疏松症的诊断和治疗提供可靠的生物标志物和潜在的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 患者入组及标本收取

纳入本研究的所有受试者均为就诊于深圳市人民医院脊柱外科的女性患者，患者年龄60～70岁。按骨密度值（T 值）和是否伴有骨折分为3 组：骨量正常组（T≥-1.0 SD），单纯骨质疏松组（T≤-2.5 SD），骨质疏松伴骨折组（T≤-2.5 SD），每组6 例。以上各组均排除患有其他器质性病变（如高血压、糖尿病、类风湿关节炎、骨坏死等）的患者。受试者知情同意后，取外周血4～5 ml 于抗凝管中，梯度密度离心法分离外周血血浆。本研究由深圳市人民医院科研伦理委员会批准。

1.2 RNA测序及miRNA差异表达谱分析

应用FlexiGene RNA试剂（Qiagen）提取上述外周血血浆RNA，各样品的RNA 纯度（OD260/280＞1.8）和浓度（50 ng/ml）均符合测序要求。RNA 测序法检测骨质疏松和骨质疏松伴骨折患者相对于健康对照组的miRNA表达谱。差异表达倍数≥2或≤-2，且P＜0.05的miRNA 为差异表达miRNA[15]。根据表达趋势，筛选出在3组（健康对照组、骨质疏松组、骨质疏松伴骨折组）之间梯度表达的miRNA。

1.3 miRNA靶点预测及功能分析

为了进一步了解目标miRNA可能调控BMSCs成骨分化的机制，通过microRNA.org（http://www.microRNA.org/）、TargetScan（http://www.targetsca-n.org/vert_72/）、miRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）、miRDB（http://mirdb.org/）四个数据库，预测目标miRNA的靶基因，应用维恩分析筛选出4个数据库共同预测出的靶mRNA[15,16]。KEGG 分析用于揭示目标miRNA 的靶mRNA 的通路富集情况。结合基因功能注释和已有研究，预测靶mRNA 的潜在功能，进一步确定目标miRNA的下游靶点。

1.4 miRNA敲低和过表达

将人BMSCs 细胞系均匀铺种于6 孔培养板上并置于5% CO2、37℃饱和湿度的培养箱中，设计合成miR-19b 的mimics、mimics control、inhibitor 和inhibitor control（吉玛基因，苏州），并应用Liposomes 2000（赛默飞，美国）转入人BMSCs细胞系，转染后48 h检测miR-19b及其下游基因表达水平变化。

1.5 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

实验细胞收集后，应用TRIzol（赛默飞，美国）提取总RNA，应用逆转录试剂盒PrimeScript RT Reagent Kit（Takara，日本）将RNA 逆转录为cDNA。设计miRNA（miR-19b）和mRNA（PTEN及下游基因、成骨相关基因）qRT-PCR 引物（生工生物，上海），应用荧光定量试剂盒（GeneCopoeia，广州）检测miRNA 和mRNA 表达量，U6 和GAPDH 作为参照基因，2-ΔΔCt法计算相对表达量。

1.6 成骨诱导后茜素红染色及成骨marker检测

将miR-19b mimics 或inhibitor 转染后的人BMSCs细胞系均匀铺种于6孔培养板和48孔板，并置于5%CO2、37℃饱和湿度的培养箱中。铺种24 h更换为成骨诱导液（赛业生物，苏州），成骨诱导后第3、7、10、14、18、21天行茜素红染色（48孔板），并应用尼康显微镜进行拍照。于成骨诱导后第7、14 天应用qRT-PCR检测成骨标志基因OPN、RUNX2、ALP表达量（6孔板）。

1.7 统计学方法

T 检验用于比较组间差异，P＜0.05 表示有统计学意义，P＜0.05和差异倍数≥2或≤-2设为差异表达miRNA 的标准，qRT-PCR 结果呈现为均值±标准差，火山图、热图、柱状图由prizm 7.0 绘制，韦恩图由FUNRICH 软件绘制，miRNA-mRNA 调控网络图由Cytoscape绘制。

2 结果

2.1 骨质疏松患者外周血miRNA差异表达谱

外周血样本测序后，我们分析了骨质疏松（伴有或不伴有骨折）患者组相对于健康受试者对照组的miRNA 表达谱（图1A），以及骨质疏松伴有骨折患者组相对于骨质疏松不伴有骨折患者组的miRNA表达谱（图1B）。结果发现，骨质疏松（伴有或不伴有骨折）患者外周血中有384 个差异表达miRNA，其中118 个上调表达，266 个下调表达。而相对于骨质疏松不伴有骨折患者，骨质疏松伴有骨折患者外周血中有338 个差异表达。进一步分析发现，9 个下调表达的miRNA 与疾病严重程度密切相关（图1C），其中miR-19b相关性最强，但miR-19b在骨质疏松骨代谢中的调控机制尚不明确。

图1 骨质疏松患者外周血miRNA差异表达谱

2.2 PTEN为miR-19b潜在靶点

为了进一步了解miR-19b 可能调控BMSCs 成骨分化的机制，我们通过microRNA.org、TargetScan、miRWalk、miRDB 四个数据库（图2A），共同预测出靶mRNA 37 个（图2B）。KEGG 提示这些靶mRNA 通路富集于cAMP通路、趋化因子通路、GnRH通路等。进一步通过基因功能分析和文献检索发现，PTEN 基因为miR-19b的潜在作用靶点（图2C）。

2.3 miR-19b通过靶向PTEN调控AKT/GSK3β通路表达

图2 miR-19b靶点预测

KEGG 通路分析提示PTEN 可抑制AKT，进而通过介导下游通路表达变化，应用miR-19b mimics 和inhibitor 在BMSCs 内构建miR-19b 过表达或敲低模型，转染48 h 后，检测PTEN、AKT，以及AKT 下游潜在基因TSC1、TSC2、FOXO1、RAF1、GSK3β、mTOR 表达量，结果显示：miR-19b 在敲低/过表达后，PTEN、AKT 表达变化与预测相符，而AKT 下游基因中，仅GSK3β 表达量有明显变化，且与AKT 表达趋势一致（图3）。

2.4 miR-19b可促进BMSCs成骨分化

为进一步验证miR-19b 是否促进BMSCs 成骨分化，应用miR-19b mimics 和inhibitor 转染BMSCs，转染后进行成骨诱导，于第3、7、10、14、18、21天行茜素红染色，结果发现，过表达miR-19b后BMSCs成骨分化能力显著增强，而敲低miR-19b 后BMSCs 成骨分化能力显著减弱（图4A）。转染后第7、14 天成骨标志基因表达量检测结果显示：过表达miR-19b后成骨标志基因OPN、RUNX2、ALP 表达量显著增加，而敲低miR-19b后上述成骨标志基因表达量显著减低（图4B和4C）。

3 讨论

图3 miR-19b敲低/过表达后，PTEN下游潜在靶基因表达变化

随着人口老龄化的加剧，骨质疏松症日益成为影响老年人生命安全和生活质量的世界性难题[17,18]。然而，当前临床上治疗骨质疏松的药物主要通过抑制骨吸收或促进骨形成来增加骨量，但存在价格昂贵、疗效不明确、长期使用有下颌骨坏死等并发症的弊端[19,20]。如何安全有效地早期诊断、早期治疗骨质疏松，是当前临床医学面临的亟需解决的问题[8]。在骨质疏松症发展过程中，BMSCs 向成骨细胞分化的能力降低，进而导致骨形成减少[21]。在分子水平探讨骨质疏松BMSCs 成骨分化减弱的机制，对了解骨质疏松症的发生和开发新的骨质疏松诊疗方法具有重要意义。

miRNAs是非编码RNA家族的成员，已被证实在不同疾病组织以及相同组织的不同阶段存在差异表达并发挥重要调控功能。已有研究报道miRNAs 在转录后通过作用于骨形成相关基因表达而参与BMSCs 成骨分化及骨形成。例如，miR-1-3p 通过靶向fryzzled 相关蛋白1 进而调控间充质干细胞分化以预防骨质疏松[22]，而miR-532-5p参与了前叉盒O1和成骨细胞分化对骨质疏松的调节[23]。miR-16-5p 通过直接靶向VEGFA 调节绝经后骨质疏松[24]，miR-765通过调控BMP6/Smad1/5/9信号通路，靶向BMP6抑制人骨髓间充质干细胞的成骨分化[25]。

图4 miR-19b可促进BMSCs成骨分化

本研究发现miR-19b 在骨质疏松患者中显著下调，且在骨质疏松伴骨折患者外周血中下调尤为明显，提示miR-19b与骨量丢失呈负相关。miR-19b在肿瘤生长调节中的作用已明确，Wei 等的研究发现miR-19b通过负性调节神经肽-1抑制胃癌的发生[26]，Tang 等的研究发现miR-19b 可促进肝内胆管癌的增殖和上皮间质转化并抑制其凋亡[27]。然而，miR-19b是否直接参与了成骨的调控，目前尚不清楚。为了进一步明确miR-19b调控成骨的作用及机制，我们首先通过数据库预测出miR-19b 的潜在下游靶mRNA共37个，并通过功能分析预测出PTEN为miR-19b在成骨调控中的潜在作用靶点。PTEN 作为一种磷酸酶，主要通过抑制AKT 及其下游信号（如mTOR 通路、GSK3β 通路、FOXO 通路、MAPK 通路等）传导来发挥作用。

通过敲低/过表达miR-19b并检测其下游基因表达变化，发现PTEN、AKT、GSK3β表达变化与敲低/过表达miR-19b 密切相关，提示PTEN/AKT/GSK3β 为miR-19b 下游通路。为进一步验证miR-19b 促进成骨的功能，我们在BMSCs中敲低/过表达miR-19b，通过茜素红染色和成骨标志基因检测证实miR-19b 可促进BMSCs成骨分化。

综上所述，本研究通过外周血测序揭示了miRNA 在骨质疏松中的差异表达谱，并发现miR-19b 与骨质疏松严重程度呈负相关。进一步研究证实，miR-19b 可通过PTEN/AKT/GSK3β 通路促进BMSCs的成骨分化，为临床骨质疏松的早期诊断和治疗提供可靠的分子标志物和全新的策略。