流苏石斛多糖抗氧化活性研究

万代林, 李秀芳, 李强明, 罗建平

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

石斛属兰科石斛属,是我国传统的药食兼用中药材,具有益胃生津、滋阴清热、保肝明目等功效[1]。研究显示,多糖是石斛发挥功效的主要活性成分之一,具有显著的抗氧化作用[2-5]。不同来源多糖的药理学研究表明,多糖对机体健康的保护作用与其抗氧化活性密切相关,多糖可通过减轻活性氧自由基对机体的过氧化损伤,达到抗肿瘤、抗衰老、保护肝脏、改善心脑系统状态等作用[6-7]。流苏石斛是2015年版《中国药典》规定的常用药用石斛之一[8],但其抗氧化作用鲜有报道。本文以流苏石斛多糖(polysaccharides fromDendrobiumfimbriatumHook.,DFP)为材料,以ABTS、DPPH和·OH自由基的清除能力为指标,测定流苏石斛多糖的体外抗氧化活性;并以糖尿病小鼠为模型,以抗超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力和抗还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的量为指标,研究流苏石斛多糖对糖尿病小鼠肝脏和肾脏组织的抗氧化保护作用,以期为流苏石斛多糖在抗氧化功能性食品方面的合理开发提供依据。

1 材 料

1.1 动物

昆明健康雄性小鼠,体质量为(22±2) g,SPF级,购自安徽省实验动物中心,合格证号为SCXK(皖)2005-001。

1.2 药品与试剂

流苏石斛购于西双版纳银海福林药业有限公司;ABTS购于北京索莱宝科技有限公司;DPPH购置梯希爱化成工业发展有限公司;四氧嘧啶购置Sigma公司;盐酸二甲双胍购于天津太平洋制药有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、还原型谷胱甘肽(GSH)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所;其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器与设备

Hei-VAP Advantage旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)、CT15RT高速冷冻离心机(上海天美科学仪器有限公司)、V1100型分光光度计(上海美普达仪器有限公司)、LBJ-18S原位真空冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)、MVS-1漩涡混合器(北京金紫光科技发展有限公司)、ACCU-CHEK罗氏血糖仪(北京宏康华泰科技有限公司)。

2 实验方法

2.1 流苏石斛多糖的提取

流苏石斛茎干粉经80%～95%乙醇脱脂干燥后,按料液比1∶30加入蒸馏水,100 ℃搅拌提取30 min,重复2次。提取液在60 ℃下减压浓缩,经离心(20 ℃,10 000 r/min)取上清液,经体积分数为80%的乙醇醇沉24 h,离心取沉淀物。将沉淀物用适量蒸馏水溶解后,经Sevag法[9]脱蛋白、透析、冷冻干燥,得流苏石斛粗多糖。

2.2 动物分组及模型建立

将实验小鼠适应性喂养1周,禁食(不禁水)24 h,随机选取15只注射生理盐水(200 mg/kg)作为正常对照组(NC),其余小鼠按200 mg/kg的量一次给予全量四氧嘧啶进行腹腔注射(四氧嘧啶用生理盐水配制成2%的溶液),然后给予正常饮食。3 d后,经12 h禁食,从注射了四氧嘧啶的小鼠尾静脉取血并用罗氏血糖仪测量血糖,将血糖浓度在11.1 mmol/L以上的小鼠纳入实验组。将75只实验组小鼠随机分成5组,每组15只,即模型对照组MC、阳性对照组PC(200 mg/kg二甲双胍)、多糖高剂量组DFP-H(200 mg/kg)、多糖中剂量组DFP-M(100 mg/kg)、多糖低剂量组DFP-L(50 mg/kg),其中多糖用蒸馏水溶解。按照每10 g0.05 mL计量灌胃,正常组和模型组给予等体积蒸馏水,连续14 d,自由进食。最后一次进食10 h后灌胃,2 h后CO2窒息死亡,解剖取出肝脏和肾脏,液氮冷冻后置于-80 ℃冰箱保存。

2.3 体外抗氧化活性的测定

参考文献[10]的方法,通过测定流苏石斛多糖对ABTS、DPPH和·OH自由基的清除能力来评价DFP的体外抗氧化活性。测定时,将多糖样品配制成质量浓度梯度为0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL的多糖溶液,并选用2.00 mg/mL的Vc溶液作为阳性对照组,每个样品质量浓度测定3个平行组。

自由基清除率计算公式为:

其中,A0为空白对照组吸光值;A1为阴性对照组吸光值;Ax为样品组吸光值。

2.4 体内抗氧化活性的测定

从-80 ℃冰箱取出肾脏和肝脏,分别加入液氮研磨,用生理盐水稀释成质量分数为10%的组织匀浆液,4 ℃下3 000 r/min离心15 min,取上清,按照试剂盒说明书检测SOD、CAT酶活力及GSH、MDA的量。

2.5 统计分析

3 结 果

3.1 流苏石斛多糖体外抗氧化活性

流苏石斛多糖对ABTS、DPPH和·OH自由基的清除结果如图1所示。

从图1可看出,阳性对照组(Vc)在实验质量浓度为2 mg/mL时,对3种自由基的清除能力均达到100%。与阳性对照组(Vc)相比,流苏石斛多糖在实验质量浓度范围内,对3种自由基均有一定的清除能力,且清除能力随多糖质量浓度的增加而增大,在多糖质量浓度为4 mg/mL时,ABTS、DPPH、·OH自由基的清除率分别为76.16%、62.66%、80.64%。

3.2 小鼠肝脏和肾脏SOD活力的变化

流苏石斛多糖对小鼠肝脏和肾脏SOD活力的影响如图2所示。

从图2可以看出,与正常对照组(NC)相比,四氧嘧啶致糖尿病小鼠肝脏和肾脏中SOD活力显著降低;与模型对照组(MC)相比,阳性对照组(PC)可明显提升小鼠肝脏和肾脏中SOD活力,与正常对照组(NC)无显著性差异。DFP各剂量组对小鼠肝脏和肾脏SOD活性的影响不同,流苏石斛多糖可显著提高小鼠肝脏SOD水平(图2a),且呈剂量效应关系,其中DFP高剂量组的小鼠肝脏SOD活力与模型对照组(MC)相比上升了128 %;但与模型对照组(MC)相比,DFP各剂量组对小鼠肾脏SOD活力的影响均无显著性差异(图2b)。图2中,不同字母表示具有显著性差异,P< 0.05，下同。

图2 流苏石斛多糖对小鼠肝脏和肾脏SOD活力的影响

3.3 小鼠肝脏和肾脏抗CAT活力的变化

流苏石斛多糖对小鼠肝脏和肾脏CAT活力的影响如图3所示。

从图3可以看出,与正常对照组(NC)相比,四氧嘧啶致糖尿病小鼠肝脏和肾脏中CAT活力显著降低;与模型对照组(MC)相比,阳性对照组(PC)可明显提升小鼠肝脏和肾脏中CAT活力,与正常对照组(NC)无显著性差异。DFP各剂量组对小鼠肝脏和肾脏CAT活力的影响不同,DFP可显著提高小鼠肾脏CAT水平,且呈剂量效应关系,其中DFP高剂量组的小鼠肾脏CAT水平与MC相比上升了78%;但与MC相比,DFP各剂量组对小鼠肝脏CAT活力的影响均无显著性差异。

图3 流苏石斛多糖对小鼠肝脏和肾脏CAT活力的影响

3.4 小鼠肝脏和肾脏GSH量的变化

流苏石斛多糖对小鼠肝脏和肾脏中GSH量的影响如图4所示。

图4 流苏石斛多糖对小鼠肝脏和肾脏中GSH量的影响

从图4可以看出,与正常对照组(NC)相比,四氧嘧啶致糖尿病小鼠肝脏和肾脏中GSH水平显著降低;与模型对照组(MC)相比,阳性对照组(PC)可以明显提升小鼠肝脏和肾脏GSH水平;DFP高、中剂量可明显提升小鼠肝脏GSH水平(图4a),DFP各剂量组均可显著提升小鼠肾脏GSH水平(图4b);与模型对照组(MC)相比,DFP高剂量组小鼠肝脏和肾脏的GSH水平分别上升了96%和53%,表明DFP能够增强小鼠肝脏和肾脏组织中非酶体系的抗氧化活力。

3.5 小鼠肝脏和肾脏MDA量的变化

流苏石斛多糖对糖尿病小鼠肝脏和肾脏MDA水平的影响如图5所示。

由图5可以看出,与正常对照组(NC)相比,四氧嘧啶致糖尿病小鼠肝脏和肾脏中MDA量显著上升;与模型对照组(MC)相比,阳性对照组(PC)可以明显降低肾脏MDA量,DFP各剂量组可不同程度地降低小鼠肝脏和肾脏MDA的量。由图5a可知在肝脏中,DFP高剂量组可降低小鼠肝脏MDA的量至正常水平,与模型对照组(MC)相比降低了40%,表明DFP能够有效保护小鼠肝脏的脂质过氧化损伤;由图5b可知在肾脏中,DFP高剂量组降低小鼠肾脏MDA的量明显,与模型对照组(MC)相比降低了25%,但MDA的量仍显著高于阳性对照组(PC)与正常对照组(NC),表明DFP对肾脏的脂质过氧化损伤具有一定的保护作用。

图5 流苏石斛多糖对小鼠肝脏和肾脏MDA量的影响

4 讨 论

正常情况下,机体内部存在的自由基防御系统可及时清除体内过多的自由基,保持机体中自由基的产生和清除动态平衡,避免发生氧化损伤[11]。SOD和CAT是组成生物体内最主要的酶促防御体系,它们能有效清除活力氧自由基并终止自由基链式反应[12]。GSH是生物体重要的抗氧化物质,其含量高低影响到非酶体系中的抗氧化能力。当SOD和CAT活力下降、GSH含量降低时会导致自由基积累,引起氧化应激,生物膜发生脂质过氧化反应,脂质过氧化产物MDA升高,机体组织发生氧化损伤[13-14]。目前认为,糖尿病及其并发症与氧化应激有很大关系,氧化应激可导致血糖调节机制受损,血糖水平升高。在高血糖状态下,抗氧化酶发生糖基化,SOD和CAT的活力下降,GSH含量减少,MDA含量增多[15]。研究表明,糖尿病小鼠肝脏、肾脏中SOD和CAT的酶活力显著低于正常小鼠,经过降血糖治疗后,其酶活力有所提高,从而提高机体不同组织的抗氧化防御能力,预防相关并发症的发生[16]。

本文研究DFP体内外的抗氧化活力,结果表明DFP具有清除ABTS、DPPH和·OH自由基的能力,对糖尿病引发器官组织的氧化应激损伤具有保护作用。在肝脏中,DFP能有效清除自由基和缓解脂质过氧化作用,保持肝脏内抗氧化与氧化动态平衡,DFP显著升高的SOD活力可将超氧自由基快速转化为H2O2,DFP升高肝脏GSH水平可以与其他酶协同发挥作用，进而有效催化H2O2分解成H2O和O2,抑制脂质过氧化反应,降低MDA量至正常水平;在肾脏中,DFP升高CAT和GSH水平可有效催化H2O2的分解,但DFP缓解肾脏脂质过氧化的作用弱于它对肝脏的抗氧化作用,表现为肾脏中MDA量的抑制程度低于对肝脏中MDA量的抑制。

本文研究表明DFP具有较好的体内体外抗氧化作用,相同抗氧化指标在不同器官中表现出差异性,反映了DFP对不同器官的抗氧化机制不同。