中医药干预肺癌细胞自噬的研究现状

马翔 马佳乐 张珊珊

2015年至2018年，肺癌连续4年位居我国发病率和死亡率第一[1]。2018年美国癌症协会一项目显示，在世界所有癌症患者中，肺癌患者的总数占到1/8[2]。肺癌的病因与多种因素有关，包括遗传、职业环境接触、吸烟及大气污染等。虽然可以通过手术、放化疗、介入、靶向、中医等方式治疗，但预后仍较差，死亡率仍然很高，因此，需要探索更为精准的分子靶向治疗[3]。细胞自噬是细胞内的一种降解途径，可以参与细胞的代谢、免疫，维持细胞的稳态[4]。近年来，多项研究表明，细胞自噬在肿瘤的发生发展过程中发挥了非常重要的作用，细胞自噬激活可清除变形、错误折叠的蛋白，维持稳定的细胞内环境，抑制肺癌细胞增殖，促进凋亡[5]；而且，自噬机制对癌细胞具有保护作用，使癌细胞具有在缺氧、饥饿环境中获取营养的能力[6]。因此，细胞自噬机制对肿瘤细胞具有双向作用，适当的调控自噬，以发挥抗肿瘤作用，对癌症的治疗具有重要意义。现阶段，中医药干预肺癌细胞自噬的研究日益增多，现将相关研究做一综述，为后续中医药防治肺癌的研究提供一定参考。

1 中医药对肺癌细胞自噬相关蛋白的研究

1.1 ATG8/LC3

LC3是研究最早的ATG8同源蛋白质，包括LC3A、LC3B、LC3B2及LC3C[7]。LC3在半胱氨酸蛋白酶 Atg4的作用下暴露出甘氨酸(glycine，Gly)残基形成LC3-Ⅰ，接着被E1泛素活化酶ATG7激活，与脂分子磷脂酰乙醇胺结合形成为LC3-II[8]。作为公认的自噬的标记基因，LC3-Ⅱ可以反映细胞中自噬水平的强弱，且在肺癌患者中的LC3B表达明显下降[9]。

周晓芳等[10]发现，苦参碱可上调LC3-Ⅱ的表达，促进自噬体形成，进而抑制肺癌A549细胞。郑心等[11]发现，肺抑瘤膏能明显抑制EGFR野生型Lewis 肺癌小鼠模型移植瘤的生长，增加自噬标志蛋白LC3表达。王林等[12]发现，黄芩苷可提高A549肺癌细胞中LC3-II的表达，增加癌细胞中自噬溶酶体的数量，其影响与黄芩苷浓度呈正相关。王程燕等[13]发现，芪冬宁方可提高肺癌A549、NCI-H460细胞的LC3B，并降低自噬相关蛋白p62水平，与药物浓度呈依赖性关系。

1.2 p62

选择性自噬受体蛋白p62是泛素化蛋白和自噬体之间的枢纽，可对底物进行选择性识别、运输[14]。当细胞内错误折叠蛋白被泛素化时，p62可与这些泛素化蛋白及LC3-II结合，然后运往自噬体进行降解[15]。在自噬发生时，P62蛋白在细胞内被利用，其表达降低，与自噬呈负相关。研究显示，在肺癌患者中P62蛋白的表达出现累积[12]。

温文浩等[16]报道了丹参酮TIIA可上调LC3-Ⅱ，抑制p62，诱导肺癌A549细胞发生自噬。张云珍等[17]研究发现，在A549肺癌细胞加入白藜芦醇50 μmol/L处理后可形成较多的自噬体，p62蛋白水平下调，LC3Ⅱ/Ⅰ上调，此外，白藜芦醇可使凋亡相关蛋白水平提高，表明白藜芦醇可诱导细胞自噬及凋亡。邵鑫等[18]将不同浓度的苯甲酰乌头原碱处理肺癌A549细胞后发现，p62 mRNA和蛋白下降、LC3 mRNA上调，改变程度与苯甲酰乌头原碱的浓度密切相关，且调控凋亡蛋白的表达，呈浓度依赖性。陈姝瑾等[19]发现，熊果酸可降低p62蛋白水平，提高LC3Ⅱ/Ⅰ比值，促进癌细胞自噬，随着浓度升高，熊果酸对肺癌细胞的抑制作用也相应增强。庞歆桥等[20]发现，黄芪甲苷具有下调P62、上调LC3I/LC3II比值的作用，联合贝伐单抗可增强抗肺癌细胞的作用。

1.3 ATG5-ATG12

ATG5是最常见的促表达变化的自噬因子。ATG5-ATG12复合物可与ATG16L1结合形成新的复合物，通过特异性的方式促进脂质和蛋白结合[21]。在自噬发生时, 分离膜外侧的ATG5-ATG12-ATG16L复合物可以提供位点给ATG8/LC3[22]。研究表明，对ATG5进行干预可影响肺癌 A549 细胞的自噬水平[23]。

王硕等[24]研究发现，中剂量香草扶正合剂显著上调ATG5、LC3B、Beclin1 mRNA和蛋白的表达水平，提高小鼠的体质量，且较化疗组更明显，提示香草扶正合剂具有较强的抗肺癌作用，与诱导细胞自噬有一定关系。程建超等[25]通过应用芪玉三龙汤干预肺癌移植瘤小鼠发现，芪玉三龙汤可使ATG5蛋白表达升高，促进ATG5 mRNA转录，阻碍小鼠肺部肿瘤的生长。罗敏等[26]报道了熊果酸促进PC9肺癌细胞中ATG5、LC3-Ⅱ表达及癌细胞中自噬泡形成，诱导细胞自噬，从而抑制癌细胞增殖。

1.4 ATG6/Beclin-1

ATG6的同系物Beclin-1可通过进化保守区(ECD)与Ⅲ型P13K形成复合物，调动相关蛋白质参与自噬，并对其它ATG的定位发挥引导作用[27]。根据不同分子的作用，Beclin1-PI3K-ATG14复合体对自噬会起到诱导或抑制双向影响；而Beclin1-PI3K-UVRAG复合体则有助于自噬体成熟[28]。

WANG等[29]报道了银杏内酯B介导的肺癌细胞自噬依赖于Beclin-1蛋白的表达，同时发现细胞自噬可抑制NLRP3炎性小体，进而抑制肿瘤细胞增殖。卢政霞等[30]研究证实，土槿皮乙酸作用可提高肺癌A146细胞中Beclin-1的水平，促进LC3从Ⅰ型转化为Ⅱ型，阻止肿瘤细胞生长。张刚等[31]发现，在非小细胞肺癌A546细胞株内加入左旋一叶萩碱处理后，肺癌细胞Beclin-1 mRNA水平提升，且与药物浓度成正相关。袁嘉瑞等[32]发现，将麦冬醇提物可使A549肺癌细胞的Beclin-1 mRNA水平升高，促进自噬体形成。庞晨等[33]等研究表明，高、中剂量的鲜铁皮石斛可使肺腺癌裸鼠移植瘤中的Beclin-1 mRNA表达增高，以抑制肿瘤生长。赵楠等[34]发现，中药提取物雷公藤红素可提高肺癌细胞中LC3B、Beclin 1 mRNA和蛋白表达，通过自噬以抑制肺癌细胞的增殖及侵袭。

在自噬体形成过程中，LC3、p62、Beclin-1、ATG5等发挥着重要作用，它们是肺癌诊断、精准治疗的新型标志物。以自噬相关基因、蛋白为靶点，对中医药抗肿瘤新药的研制具有重要意义。目前，中医药相关研究多集中于LC3、p62、Beclin-1等自噬蛋白，且大多为中药活性成分，对ATG5-ATG12及Unc-51样自噬激活激酶1等自噬相关蛋白缺乏中医药全面、深入的研究。中医药对自噬基因干预方向的研究仍相对薄弱，肺癌的形成及治疗机制尚未完全阐明，还需继续探索和不断验证。

2 中医药对肺癌细胞自噬相关信号通路的研究

2.1 磷脂肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphninositide3-kinase/protein kinase B/the mammalianta target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR)信号通路

细胞自噬与PI3K/Akt/mTOR通路密切相关，当营养充足时，在PI3K与Akt的作用下，mTOR被激活，形成mTORC1复合体，阻碍ULK1激活，使自噬受阻[35]；在营养不足时，mTORC1受到抑制，下调了mTORC1复合体的形成，激活ULK1，促进细胞自噬[36]。此外，AKT还可与Beclin-1结合诱导肺癌细胞发生自噬[37]。

陈春苗等[38]发现，低浓度的白藜芦醇与顺铂联用比单用顺铂可更明显下调肺癌细胞中 PI3K、AKT、mTOR、p62的蛋白表达，上调LC3-II、Caspase3、Bax，提高自噬小体的数量，表明白藜芦醇联合顺铂可负向调控PI3K/Akt/mTOR通路，从而促进肺癌细胞调亡与自噬。而王雪林等[39]发现，黄芪多糖可降低PI3K、LC3B，上调Akt、p62水平，使肺癌细胞自噬体减少，抑制自噬，使肺癌细胞处于缺氧环境，阻断其生长。周立江等[40]发现，肺积宁方可上调肺癌细胞Beclin-1、Atg5、LC3B-Ⅱ蛋白的表达，下调 mTOR、AKT、p-AKT蛋白水平，增加自噬小体的数量，诱导自噬以发挥抗癌作用。杨佩颖等[41]证实了在耐药细胞株中消岩汤可以下调 AKT1 和 mTOR 基因的表达，进而干预AkT/mTOR通路抑制肺癌细胞的增殖。孟东雪等[42]发现高浓度扶正抑瘤汤处理A549肺癌细胞后，可下调p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR的表达，上调Beclin-1、LC3蛋白，促进肺癌细胞中自噬溶酶体形成，抑制肺癌细胞增殖，同时扶正抑瘤汤也可提高A549肺癌细胞的凋亡率。

PI3K/Akt/mTOR是经典的信号通路之一，多项研究均已证实中医药在干预PI3K/Akt/mTOR通路诱导自噬中的作用。miRNA可调控PI3K/Akt/mTOR信号通路，从而影响细胞自噬，中医药是否通过影响miRNA表达，调控PI3K/Akt/mTOR通路与自噬的发生，需要进一步深入研究。

2.2 p53蛋白/磷酸腺苷蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白(p53/AMP-activated protein kinase/mammalian target of rapamycin，p53/AMPK/mTOR)信号通路

p53是细胞自噬重要的调控因子，p53可诱导Sestrin1/2与AMPK的Thr172发生磷酸化或激活β1、β2 亚基，然后激活AMPK[43]。活化后的AMPK可磷酸化TOR1调节相关蛋白，降低mTORC1活性，或直接磷酸化ULK1，从而干预细胞自噬[44]。

LI等[45]研究证实，参皂苷代谢产物K可激活AMPK-mTOR和JNK信号通路，上调LC3II和Beclin-1表达，抑制p62表达水平，诱导非小细胞肺癌细胞自噬。该团队进一步的研究表明，参皂苷代谢产物K可在一定程度上解除AMPK抑制剂、JNK抑制剂对肺癌细胞自噬的抑制作用。KIM等[46]发现，经黄芩处理后非小细胞肺癌细胞H358、H2087中，AMPK、P70-S6激酶的磷酸化水平升高，下游靶点S6K也被激活，LC3Ⅱ/Ⅰ表达也相应提高。而当抑制AMPK磷酸化时，黄芩的凋亡作用被抵消，提示黄芩诱导的自噬依赖于AMPK通路的激活。彭鹏等[47]发现，重楼皂苷Ⅰ与AMPK有着很强的亲和力，可抑制蛋白酶对AMPK蛋白的分解，重楼皂苷Ⅰ通过激活 AMPK/mTOR 通路，提高AMPK蛋白磷酸化，诱导非小细胞肺癌(PC9、H460)自噬，起到抑制肺癌作用。文兰香等[48]研究表明，中药黄酮类槲皮素可活化AMPK/mTOR通路，调控p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、p-S6K/S6K表达，上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白，而槲皮素联合AMPK抑制剂则降低AMPK磷酸化，下调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白，提示肺癌细胞自噬体形成与AMPK/mTOR通路的激活密切相关。

基于上述自噬相关信号通路的研究可见，mTOR是涉及较多的作用因子，对自噬具有负性调控作用。中医药抑制肺癌的相关研究可以mTOR为切入点，通过影响mTOR，调控相关信号通路，诱导自噬，为新药创制提供思路。

2.3 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路

在MAPK通路中，细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular-signal regulated kinase，ERK)通路等可被RAS等磷酸化激活，进而参与细胞增殖、癌变等[49]。MAPK信号通路位于活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的下游，在诱导细胞凋亡和自噬中起重要作用[50]。

FAN等[51]报道了鸦胆子素D可上调肺癌细胞p-ERK、p-JNK表达，激活MAPK信号通路，从而提高ROS的水平，提高LC3-II/LC3-I比值，下调p62表达，促进自噬小体的形成。而经ROS清除剂预处理后，鸦胆子素D诱导自噬的作用则被抑制。SHEN等[52]研究证实，芦荟大黄素通过激活MAPK信号通路，诱导细胞自噬，引发细胞凋亡，降低非小细胞肺癌细胞存活率，而与上述鸦胆子素D相同，芦荟大黄素诱导的自噬为ROS依赖型，可被ROS清除剂NAC抑制。张雪琴等[53]报道了迭鞘石斛乙醚提取物可以促进肺癌细胞中RAS相关蛋白的表达，从而抑制肺癌细胞的增殖。王伟等[54]人通过研究发现，雷公藤甲素可上调 p-ERK/ERK 蛋白和LC3-Ⅱ蛋白表达，通过影响ERK蛋白磷酸化可诱导细胞自噬，ERK属于MAPK家族，因此该团队推测雷公藤甲素诱导的细胞自噬与MAPK通路相关。然而，一些研究发现，细胞自噬对肺癌细胞起保护作用。WANG等[55]用不同浓度的白藜芦醇对肺癌A549和H1299细胞进行处理发现，白藜芦醇可上调Beclin-1、LC3 II/I表达，诱导自噬，而自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤可抑制自噬，促进癌细胞凋亡，提示白藜芦醇诱导的自噬可能对肺癌细胞起保护作用，进一步的研究发现白藜芦醇可抑制p38-MAPK通路激活，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。

信号通路是细胞外信号分子向内传递的途径，多种信号通路之间相互影响，并非单一发挥作用，在对信号通路的影响上，中药有独特优势，可以多靶点、多通路发挥作用，中医药干预自噬相关信号通路的研究将是今后的研究热点。现阶段基于自噬相关信号通路的研究多集中在中草药主要活性成分，而中医药复方、中医外治等相关研究较少，深入研究中医药经典方剂及外治法通过调控自噬相关通路，影响肺癌细胞增殖、侵袭，为临床应用提供指导。

3 中医药对线粒体自噬的研究

当细胞耗氧量增多，线粒体氧化磷酸化会被抑制，导致ROS累积。过量的ROS通过改变线粒体膜电位，激活天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)，促进细胞凋亡[56]。此外，ROS可抑制三羧酸循环，使ATP生产减少，影响糖酵解代谢[57]。线粒体自噬可通过选择性自噬降解受损及多余的线粒体，减少ROS积累，维持细胞稳态，若线粒体自噬受阻，会使ROS不断累积，使糖酵解代谢产生过量乳酸，影响机体代谢[58]。PTEN激酶1(PTEN-induced kinase 1，PINK1)/E3泛素连接酶Parkin信号通路是介导线粒体吞噬最典型的途径。

线粒体蛋白抑制素PHB/PHB2可与LC3相互作用，诱导细胞线粒体自噬，闫雨廷等[63]创新性的发现了萝卜硫素可下调人非小细胞肺癌SK-1细胞的PHB水平，抑制自噬体与溶酶体结合，进而抑制线粒体自噬。该团队还发现萝卜硫素可通过破坏微管平衡，以抑制线粒体自噬。

除PINK1/parkin 介导的泛素依赖性线粒体自噬，还有直接与LC3结合的非泛素依赖性线粒体自噬。现阶段发现的有非泛素依赖性自噬受体主要有BNIP3、FUNDC1、NIX、BCL2L13等。中医药通过PINK1/parkin通路影响线粒体自噬的相关研究较多，而对上述非泛素依赖性自噬受体及线粒体自噬适配体NDP52、OPTN的研究则尚无报道。

4 中医药对内质网自噬的研究

肺癌细胞的内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可诱导自噬从而清除受损及多余细胞，从而调节免疫功能[64]，而持续过激的ERS则可促进癌细胞凋亡。Perk/IRE1/c-ATF6是干预ERS的主要信号通路，p-Perk 可下调ERS的水平，抑制细胞凋亡[65]。

汪超等[66]研究发现，橙皮素可诱导内质网应激相关蛋白 CHOP、 Caspase4、 Bip、 pJNK 及感受器蛋白 p-Perk、 IRE1 和 c-ATF6 表达水平上调。另有研究表明，丹参二萜醌可显著上调IRE1α、Bip、TRAF2表达，从而促进肿瘤细胞的ERS，促进癌细胞的凋亡[67]。X盒结合蛋白(X-box binding protein 1，XBP1)具有影响脂质代谢，抑制免疫细胞的作用，在肺癌患者中，XBP1蛋白的表达明显增多[68]。杨冰等[69]发现，黄芪黄酮可显著下调肺癌细胞中XBP1及IRE1的表达，表明黄芪黄酮抗癌功效可能与其调控XBP1介导的 ERS相关。

5 结语与展望

中医药是祖国传统文化的结晶，可通过多靶点、多途径干预肺癌细胞的自噬，抑制肺癌细胞的增殖，对于临床肺癌患者的治疗具有重要意义。虽然现阶段中药对肺癌细胞自噬的影响的研究越来越多，但仍然存在着一些问题：(1)肺癌的病因尚未完全阐明，多种基因、多种信号通路都可产生影响，给研究带来困难；(2)目前自噬与肺癌细胞的相关研究，主要为体外细胞培养实验，这是因为自噬体在体内研究需要持续监测，后续的研究方案应突破这种局限性，注重在肺癌体内模型中分析自噬的作用，得到更为可靠的结论；(3)中医药多集中于对PI3K/Akt/mTOR、p53/AMPK/mTOR、MAPK等热点通路的研究，对其他信号通路的尚需深入、系统地研究；(4)中医药对于线粒体及内质网自噬的研究较少，且多以中草药单体成分为主；(5)中医药具有多靶点作用的特性，中药成分较复杂，难以控制单一变量，而且中医辨证理论难以与细胞自噬机制相结合，这都给研究带来挑战；(6)非编码RNA对自噬及肺癌细胞的影响已被证实[70]，中药可通过调控LncRNA、miRNA以影响细胞自噬。后续会以“LncRNA/miRNAs—自噬相关信号通路—自噬相关蛋白”为研究点，未来进行更为深入、系统的生物分子学实验研究，注重细胞自噬的体内模型研究设计，以开拓中医药治疗肺癌的应用前景。