泛素特异性蛋白酶在心血管疾病中的研究进展

王妍莉 滕宗艳

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是导致死亡的重要原因，给人们的身心健康造成巨大负担。目前，CVD的发病率在世界范围内仍不断上升，积极寻找防治CVD的途径迫在眉睫[1]。近年来，人们发现泛素特异性蛋白酶(ubiquitin specific proteases，USPs)在动脉粥样硬化(atherosis，AS)、心肌缺血再灌注损伤、心力衰竭(心衰)等CVD中发挥重要作用，通过各种通路调控着CVD的发生发展过程。本文就USPs在CVD中的作用进行综述，旨在为CVD的防治提供一个新的途径。

1 USPs概述

1.1 泛素化途径及去泛素化酶(deubiquitinating enzymes, DUBs)分类 泛素是一类真核细胞内广泛存在的大小为76个氨基酸残基的小分子蛋白质，可与多种形式的特异性靶蛋白偶联，即多泛素化和单泛素化。泛素化修饰的过程是在ATP供能的情况下，泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme, E1)激活泛素，转移到泛素结合酶(ubiquitin-conjuagtion enzyme, E2)上，再和泛素连接酶(ubiquitin-ligase enzyme，E3)共同识别靶蛋白，对其进行泛素化修饰，从而影响靶蛋白的活性、定位、蛋白之间的相互作用及稳定性，参与调控蛋白酶体对蛋白质的选择性降解、细胞信号转导、转录、转运、自噬和免疫反应等过程[2-4]。DUBs是逆转泛素化的一类酶。大约有100个人类基因组编码的DUBs被发现，他们目前可分为6个家族：USPs、泛素羧基末端水解酶家族(ubiquitin carboxyterminal hydrolases, UCHs)、卵巢肿瘤相关蛋白酶家族(ovarian-tumor proteases, OTUs)、Machado-Joseph疾病蛋白酶家族(Machado-Joseph disease protein domain proteases, MJDs)、单核细胞趋化诱导蛋白家族(monocyte chemotactic proteininduced protein, MCPIPs)和JAMM/MPN金属钛酶家族(JAMM/MPN domain-associated metallopeptidases, JAMMs)，其中只有JAMMs是锌金属钛酶，其余5个家族皆是半胱氨酸钛酶[5]。

1.2 USPs的结构和功能 USPs是DUBs中占比最多的成员，有近60个子成员。每个子成员都具有像手指、拇指和手掌一样的3个区域组成的高度保守的USPs结构域，USPs的催化中心位于手掌和拇指的交界区域。也有一些USP具有其他结构域，如头帕肿瘤综合征蛋白(CYLD)的B-box结构域，USP3、USP5、USP39、USP44、USP45、USP49、USP51的锌指结构域，USP4、USP7、USP14、USP32、USP47和USP48的泛素样结构域，USP52的核酸外切酶Ⅲ结构域等。USPs结构域的数量和多样性与其功能的多样性密切相关，使其成为许多研究的重点。已经有大量研究表明，USPs参与调控细胞的生长、增殖、凋亡等多种生物学过程，在肿瘤、神经退行性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、CVD等多种疾病的发生发展过程中扮演重要角色[6]。USPs不仅维持着心脏正常生理活动，而且调控着CVD的病理过程。

2 USPs与CVD

2.1 USPs与心脏电生理 电压门控钙通道(voltage gated calcium channel，Cav)可以调节心肌兴奋性和收缩性。心脏中钙通道的定位和表达，可以调节窦房结心率，也可以调节房室结传导，还可以调节工作心肌的心脏复极。钙通道功能紊乱会导致心肌细胞异常兴奋和心律失常[7]。已有研究证明，USP2-45可使上皮细胞钠通道去泛素化并调节其在质膜上的表达[8]。USP8调控上皮细胞钠通道的内体转运[9]。也有研究证明，USP2-45和USP2-69均可对抗神经前体细胞表达发育抑制蛋白4-2(Nedd4-2)依赖的泛素化，从而恢复KCNQ1钾通道的质膜定位[10]。既然USP可调节钠通道和钾通道，那么他在钙通道中是否也有调节作用？Pouly等[11]发现USP2-45在细胞膜翻译后水平具有时钟输出效应，并可能调节Ca2+的膜通透性。Rougier等[12]发现USP2-45和USP2-69均可使心脏Cav通道去泛素化。USP2-45作为研究的重点被发现可降低质膜上的Cav通道的数量。可见USPs对维持离子通道的稳定具有重要作用，可能成为治疗CVD的一个靶点。

2.2 USPs与AS

2.2.1 USPs对AS病因的影响：CVD的危险因素如高血压、糖尿病、血脂异常、肥胖、吸烟等是AS的病因，积极预防以上这些病因，可以减少AS的发生。越来越多的研究表明，USPs与这些病因密切相关。

LDL水平的升高是AS的主要病因。LDL受体(LDLR)的突变使肝脏对LDL的清除减少，血浆胆固醇水平升高，从而加速AS，因此LDLR水平的稳定调控就显得格外重要了。Nelson等[13]发现USP2与偶联酶相互作用并促进其去泛素化，然后和LDLR组成复合体控制LDLR的降解。USP2调控脂蛋白代谢，为血脂异常和AS疾病的治疗提供了可能。

肥胖的一个标志是脂肪生成功能障碍。Yang等[14]研究发现，十字花科蔬菜(如卷心菜)中富含的一种衍生物吲哚-3-甲醇在胃酸作用下代谢成更为稳定的3,3′-二吲哚甲烷(3,3′-diindolylmethane，DIM)，DIM通过抑制USP2活性在脂肪生成早期抑制细胞周期进展，诱导细胞周期蛋白D1的翻译后降解，从而起到抗肥胖作用。Huang等[15]研究了cullin-RING E3的调节因子COP9信号体的下调可以提高C/EBP同源蛋白抑制脂肪滴形成的作用，而USP15参与调控其过程。Akoumianakis等[16]研究发现，脂肪组织分泌体释放的无翅相关整合位点5A通过USP17/RAC1介导的血管平滑肌细胞的NADPH氧化酶激活，调控肥胖对人类动脉氧化还原状态的影响，以此说明USP17和无翅相关整合位点5A是预防和治疗与人类肥胖有关的血管并发症的有效靶点。

脂肪组织的慢性炎症会加速脂肪细胞释放脂肪细胞因子和脂质因子。Saito等[17]的研究表明，巨噬细胞USP2A(一种较长的USP2剪接变体)通过脂肪细胞依赖机制改善肥胖诱导的胰岛素抵抗。也有研究表明，肝脏USP4过表达可明显减轻非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)小鼠的肝脂肪变性、胰岛素抵抗和炎症反应[18]。Zhang等[19]的研究表明，运动可以增强肝USP4、USP18和双特异性磷酸酶14对TGF-β活化激酶-1 (TGF-β-activated kinase 1, TAK1)磷酸化的抑制作用，来改善高脂饮食诱导的肥胖大鼠的胰岛素抵抗。An等[20]的研究表明，USP18过表达也可以改善NAFLD小鼠的肝脏脂肪变性及脂质代谢紊乱。Ji等[21]发现CYLD通过与激酶TAK1相互作用并使其去泛素化，防止JNK-p38信号通路的活化来减轻肥胖小鼠的脂质积聚、胰岛素抵抗、肝脏炎症标志物的表达。而与USP2、USP4、CYLD可以改善胰岛素抵抗不同的是，有研究表明USP14过表达可促进肝甘油三酯的积累，而USP14的下调可以改善肥胖小鼠的骨质疏松、高血糖、高胰岛素血症和胰岛素抵抗[22]。以上这些研究表明USPs可能通过调节脂质代谢、肥胖、血糖等因素影响AS的发生发展。

2.2.2 USPs在AS病理过程中的影响：AS的3个病理阶段是：(1)动脉内膜的巨噬细胞和少数平滑肌细胞灶性积聚，细胞内外脂质沉积；(2)内膜增生的结缔组织和含有脂质的平滑肌细胞、巨噬细胞组成的纤维病变；(3)纤维斑块出血、坏死、溃疡、钙化、附壁血栓形成的复合病变。炎症是构成AS的病理基础，而巨噬细胞是主要的促炎因子。Kitamura等[23]的研究表明，USP2抑制脂多糖诱导的巨噬细胞样细胞促炎细胞因子的表达。Jean-Charles等[24-25]在AS的小鼠模型中发现USP20可以抑制平滑肌细胞炎症及颈动脉内膜增生，并进一步证明USP20通过抑制肿瘤坏死因子(TNF)触发的平滑肌细胞炎症来对抗AS。Takami等[26]在颈动脉球囊损伤的大鼠模型中发现CYLD过表达显著抑制新生内膜形成，且表明CYLD可能通过抗炎和抗增殖作用减轻球囊损伤后的血管重构。研究还证实了在血管内皮细胞中，CYLD通过去泛素化TNF受体相关因子2抑制NF-κB活性来抑制炎症和内皮细胞增殖，CYLD可能通过去泛素化Bcl-3抑制cyclin D1和E2F活性来抑制平滑肌细胞的增殖。Liu等[27]的研究表明，在血管平滑肌细胞中，CYLD通过激活TNF-α诱导的有丝分裂原活化蛋白激酶促进炎症反应，而这个过程并不影响TNF-α诱导的NF-κB活性。血管外膜的成纤维细胞被外力刺激后分化为肌成纤维细胞，分泌多种物质，引起血管张力改变、血管炎症发生和血管扩张等一系列反应，参与AS、血管重建的过程。Yu等[28]发现高同型半胱氨酸血症小鼠通过上调Nox4促进血管外膜成纤维细胞的转分化和促炎细胞因子产生以及加重腹主动脉瘤。进一步证实CYLD通过去泛素化Nox4诱导血管外膜成纤维细胞的转分化。衰老可加剧AS的进展。Imaizumi等[29]报道了CYLD可能通过改变单核细胞对内皮细胞的黏附、巨噬细胞的脂质积聚和炎症反应来调节年龄相关的AS的发生。USPs可能成为治疗AS和血管炎性疾病的一个新靶点，也为该病的发病机制提供新的见解和方向。

2.3 USPs与心肌缺血再灌注损伤 心肌缺血再灌注损伤是急性心肌梗死后一段时间的再灌注反而加重心肌损伤的病理过程。其发生机制可能与氧自由基的产生、钙超载、炎性细胞浸润、能量代谢紊乱等有关，严重时可导致恶性心律失常和猝死。因此，探索其防治措施很重要。Yu等[30]报道了β1肾上腺素能受体(β1-adrenergic receptors，β1AR)诱导的USP20活化可稳定β1AR在病理性心肌损伤中的表达。另外，Zhang等[31]的研究表明，在再灌注损伤后的AC16心肌细胞中，USP49水平呈时间依赖性增加，且USP49抑制了心肌细胞的凋亡和应激活化蛋白激酶1/2(JNK1/2)的激活。研究还表明，USP49通过双特异性蛋白磷酸酶1-JNK1/2信号通路抑制缺血再灌注损伤诱导的AC16心肌细胞存活抑制和凋亡。在心脏缺血再灌注损伤中具有保护作用的USP49可能成为防治心肌缺血再灌注损伤的一个靶点。

2.4 USPs与心衰的病理生理机制 心衰的发生发展涉及复杂的病理生理学机制，包括神经体液激活、心肌肥厚、心室重构、体液因子改变及炎症等。心肌肥厚是心脏后负荷增高时的主要代偿机制，病理性心肌肥厚多由应激反应或疾病引起，可以独立预测各种CVD。因此，寻找新颖且有效的防治心肌肥厚的靶点日益突出[32-33]。有研究表明正常心脏中USP4高表达，而人衰竭心脏和小鼠肥厚心脏中其水平持续降低。体外研究表明，内源性USP4的缺乏可促进体外血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大，而USP4的恢复可有效缓解这种促肥大作用。在体内研究中，USP4全敲除压力超负荷诱导的小鼠心肌肥厚和纤维化加重，而心脏特异过表达USP4的小鼠病理性心肌肥厚有所改善。体内外研究的一致性说明USP4具有减轻病理性心肌肥厚和心衰的作用，而USP4对心肌肥厚的保护作用主要依赖于其去泛素化活性导致的TAK1-(JNK1/2)/p38信号通路的抑制。在腹主动脉缩窄诱导的左心室肥厚模型中，大鼠左心室组织中USP14表达增加，在血管紧张素Ⅱ诱导的初生大鼠心肌细胞肥大模型中，USP14表达也增加，且证实USP14的含量在心肌肥厚各个阶段都有升高。研究也表明USP14可通过促进糖原合成酶激酶3β磷酸化，来促进心肌肥厚的发展[34]。Isumi等[35]通过对USP15过表达的转基因小鼠心脏的研究发现，USP15去泛素化骨骼肌LIM蛋白1 并与其相互作用可导致心脏重构、心脏体积增大，说明USP15参与了心肌肥厚的调控。研究表明无论是在扩张型心肌病病人的心脏，还是压力超负荷诱导的肥厚性小鼠心脏及血管紧张素Ⅱ刺激48 h后的新生大鼠心脏，USP18的表达都是升高的。并且验证了同非转基因小鼠相比，心肌细胞特异性过表达USP18的小鼠心脏有下列特点：心脏扩张和衰竭延缓，心肌肥厚、病理性纤维化减轻。而USP18过表达抑制心脏重构和延缓心脏功能障碍的过程依赖于TAK1的p38和JNK1/2信号通路的阻滞[36]。Wang等[37]发现主动脉弓横向缩窄后的小鼠心脏和血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥厚小鼠心脏以及尸体解剖获得的人类肥厚和衰竭心脏，CYLD的表达皆上调，而敲除CYLD的主动脉弓横向缩窄小鼠的心肌肥厚、纤维化、凋亡、氧化应激和功能障碍程度均减轻。并进一步证明CYLD能够抑制细胞外调节蛋白激酶(ERK)、p38/AP1和c-Myc/Nrf2通路的激活，从而加重心脏氧化应激。

这些研究表明，USPs通过各种通路或改善或促进心肌肥厚，影响着心衰的发生发展过程，这些影响使得USPs可能成为治疗心衰的有效靶点。

3 总结与展望

USPs与心脏的正常电生理活动、AS、心肌缺血再灌注损伤、心衰的病理生理过程等息息相关，通过多种信号通路参与CVD的发生发展，为我们研究CVD提供了新的思路。通过调控USPs及其参与的各种信号途径，有望成为防治CVD的新措施。USPs在心衰病理生理过程中的作用也使得其可能成为心衰的一个新型标记物。但是，USPs是否通过影响其他信号通路作用于CVD，以及已经发现的相关信号通路的潜在机制仍有待进一步阐明。另外，USPs的其他子成员在CVD中是否也有着相似的作用也需要我们进一步探索。总之，现有的研究表明USPs为血脂异常、AS、心肌缺血再灌注损伤及心衰的诊治提供了可能。