肠道菌群与肠道免疫相关研究进展

孙炘宸，赵晶晶，薛珊珊，吴拥军*

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210029；2.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029)

0 引言

肠道菌群是寄居在肠道内微生物群落的总称，其种类丰富数量众多，据统计定居于成年个体内的微生物约有1014个，是自身细胞数的10倍左右[1]。由于其具有消化、代谢、免疫等多种功能，被诸多学者称为虚拟器官。早在上世纪六十年代，GF(Germ-free)级动物模型的建立使得人们发现了肠道菌群有促进肠相关淋巴组织(gut-associated lymphoid tissues，GALTs)发生及成熟的作用[2,3]。肠道作为体内最大的免疫器官，产生了全身近80%的抗体，大量研究表明肠道菌群失调与诸多疾病发病相关，而免疫系统则是重要的中间环节。探讨肠道菌群和免疫系统的相互作用能解释众多生理和病理机制。近年来，肠道菌群与肠道免疫系统的研究取得了一定进展，现总结如下。

1 肠道菌群与肠道免疫系统发育的相关性

过去，学者多认为胎儿消化道处于无菌状态，与外界接触后微生物逐渐定植，至三个月左右逐渐形成一个较稳定的群体[4]。近来有研究表明这一过程可能源于出生之前[5,6]，胎儿的菌群组成与羊水群落相似[7]。菌群对肠道免疫系统发育的影响主要体现在形成合适的肠道环境与促进GALTs发生及成熟两个方面。婴儿出生后的几小时内，大量需氧菌与兼性厌氧菌定植，影响肠道CD4+、CD8+T细胞的数量与活化状态，改变了CD4亚群分布与肠道微结构，并与母乳中的免疫球蛋白共同帮助婴儿适应外界复杂的抗原环境[8]。同时创造相对无氧的环境，为厌氧菌的定植做好铺垫[9]。出生后的1-7天，大量厌氧菌定植，肠道菌群数量呈爆炸式增长，在菌群的影响下，单核细胞与巨噬细胞不断发育直至成熟，中性粒细胞数目到达峰值[10]。肠道菌群在多个方面影响着免疫系统的发育：如婴儿断乳后，在缺乏外来分泌性免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，SIgA)的情况下，大肠埃希菌、双歧杆菌等促进B细胞的成熟与免疫球蛋白的分泌[11,12]；某些微生物信号促进了调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)及自然杀伤T淋巴细胞的发育[13]；肠道菌群通过诱导淋巴组织诱导细胞(lymphoid tissue inducers，LTi)，协助派伊尔结(Peyer's Patch，PP)、孤立淋巴滤泡、阑尾及肠系膜淋巴结的形成[14]等。有学者推断，肠道菌群对于GALTs的正常发育一定程度上依赖其病原相关模式分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)与相应的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRRs)结合并激活下游的信号通路，但具体机制尚不明了[15]。

2 肠道菌群与肠道免疫细胞的相互作用

2.1 T淋巴细胞

多种肠道菌群均可刺激T淋巴细胞产生免疫应答，协助其增殖与分化，并促进各细胞亚群分泌不同的细胞因子。肠道菌群对T淋巴细胞的影响主要体现在Treg和辅助T细胞(T helper cells,Th)两方面，如梭状芽孢杆菌促进Treg的增殖分化[16]，分节丝状菌促进Th17的增殖分化[17]。此外菌群代谢生成的短链脂肪酸(SCFAs)，也可以促进Treg的形成[18]。Treg的主要作用是维持免疫耐受，防止对肠道菌群的过度免疫。多种肠道菌群均可增加Foxp3在CD4+Treg和CD25+Treg中的表达、促进IL-10生成，抑制髓系细胞和Th17的异常活化，防止过度免疫[19]。大鼠肠道菌群缺失会导致体内RORγt+Treg细胞缺如。与菌群相关的Th亚群中以Th17的研究较多。研究表明，分节丝状菌介导Th17的产生与分化是通过肠上皮细胞、ILC3和单核细胞等多种途径互相作用实现的[20]。Th17主要功能是介导炎症反应，分泌IL-17、IL-22等促炎症因子[21]。Treg与Th17的功能相互制衡，二者的平衡对于维持肠道稳态意义重大，肠道菌群在其中起到了一定的作用。

2.2 B淋巴细胞

肠道菌群对B细胞免疫的影响主要体现在其分泌免疫球蛋白的过程中。早年即有研究表明，肠道菌群缺乏会导致PPs发育不成熟，外周SIgA、SIgM水平降低[3]。此后研究发现其与B淋巴细胞相关。目前对此的研究大部分聚焦在SIgA上。菌群通过两种途径影响B淋巴细胞分泌SIgA：(1)T细胞依赖型主要发生在PPs中，多由致病菌引发。M细胞提呈微生物抗原至树突状细胞(Dendritic cells,DCs)，后者促使T淋巴细胞分化为滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cell, Tfh)亚群。Tfh通过表达CD40L和IL-21，诱导B细胞表达胞嘧啶核苷脱氨酶并促进IgA的抗体类别转换，产生高亲和力SIgA[22-24]。(2)非T细胞依赖型主要发生在固有层与孤立淋巴滤泡，肠道菌群多激活此途径。DCs通过Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)感知菌群后产生B细胞激活因子与增殖诱导配体，诱导B细胞胞嘧啶核苷脱氨酶的表达，产生低亲和力SIgA[22-24]。但机体如何识别不同细菌的机制仍未被发现。SIgA对菌群的影响表现在物理隔绝与调节免疫两个方面：如隔绝微生物、保护免疫球蛋白、中和肠酶肠毒素；及激活局部免疫、抑制变态反应、形成免疫耐受等[25]。近年发现SIgA尚能直接调控细菌的基因表达[26]与影响菌群分布[27]。此外，亦有学者发现SIgM在致耐受的过程中也起到了重要的作用，其部分功能与SIgA相重合且其免疫效力要强于SIgA[28]。

2.3 DCs与巨噬细胞

二者均为髓系细胞。DCs是一种重要的抗原递呈细胞，而巨噬细胞除了抗原递呈作用外，还具有吞噬功能。过去，学者已经发现其表面的PRRs(主要是TLRs)能起到识别作用[29]。近年研究发现，DCs通过PRRs能够识别肠道菌群中的微生物，激活MyD88和TRAM-TRIF信号通路[30]或通过上皮细胞NOD2蛋白激活NF-κB信号通路，分泌相关的细胞因子促进Treg的分化[31]。SCFAs则能够上调DCs H3K4的三甲基化状态，并诱导IL-6和IFN-β1的分泌从而激活自然杀伤(cNK)细胞[32]。肠道菌群还能通过影响CD103+DC，从而影响肠归巢受体CCR9和整合素α4β7(α4β7-integrin)[33]。亦有研究发现，菌群通过DCs激发Mincle-Syk轴，帮助PPs中的细胞生成IL-17与IL-22[34]。

2.4 固有淋巴细胞(innate lymphoid cell,ILC)

ILC是呈现淋巴样形态但无基因重排的抗原受体样细胞[35]，分为ILC1、ILC2、ILC3三个亚群。其中cNK细胞、LTi细胞分属ILC1与ILC3[36,37]。三类的功能分别与Th1、Th2、Th17有所类似[38]。其细胞毒与分泌细胞因子的功能需依赖于肠道菌群并受其调控[39]。菌群代谢物如视黄酸(RA)能够帮助ILC1与ILC3从CCR7转变为CCR9进而迁移至肠道[40]。但具体的作用机制尚存在争论，是近来的研究热点。近来研究发现ILC3具备呈递菌群相关抗原的能力并能够抑制相应T细胞的活性[41]。说明ILC3的功能除了通过分泌相关细胞因子直接影响菌群，也可以通过适应性免疫系统促使菌群形成免疫耐受。

2.5 潘氏细胞

潘氏细胞是消化道特有的免疫细胞，能通过TLRs-MyD88信号通路直接感受菌群刺激，释放防御素[42,43]。潘氏细胞被删除的小鼠不能控制肠道共生菌与致病菌的侵入，说明潘氏细胞对于控制肠道菌群稳态有着重要作用[44]。同时，肠道菌群通过表达去磷酸酶以去除细菌表面的负电荷，从而抵御防御素等阳离子抗菌类多肽的杀伤[45]，形成平衡。

3 肠道菌群对肠道屏障的作用

3.1 肠道菌群对肠道粘膜机械屏障的作用

肠道菌群与肠道上皮黏附形成生物性机械屏障。菌群通过竞争生存空间，占据结合位点来抑制致病菌，某些特定菌群还能产生细菌素等直接抑制或杀灭致病菌[46]。例如乳酸杆菌可通过分泌抗菌物质、调节肠道pH等途径抑制某些病原菌的定植[47]。肠道上皮表面亦有PRRs存在，当普通小鼠肠上皮受到损伤时，肠道菌群能够快速识别TLRs，阻止肠上皮细胞受损并促进其分化增殖，其速率远高于无菌小鼠[3,48]。菌群通过TLR2信号途径能够加固肠上皮连接，改变其通透性从而加强屏障功能[49]。此外，菌群还可根据肠道位置影响肠上皮细胞miRNA的表达[50]。

3.2 肠道菌群对肠道粘膜免疫屏障的作用

肠上皮细胞表面覆盖着由杯状细胞产生的黏液，这些黏液形成保护屏障，隔绝大部分细菌与肠道上皮的直接接触[51]。不同部位黏液层的组成有一定差异，但其主要成分均为黏蛋白与抗菌物质[52]。菌群通过PAMPs促进黏液分泌[53]。无菌小鼠[54]与抗生素暴露小鼠[55]肠道的杯状细胞数量明显减少，并且黏液层缺乏重要免疫分子，表明肠道菌群对黏液层的形成具有重要作用。肠道菌群代谢产生的SCFAs在低浓度下对黏液的分泌与黏蛋白MUCs2的表达起促进作用，在高浓度下起抑制作用[56]。

除了黏液的分泌外，肠上皮细胞在持续与微生物或其产物接触后，也能直接产生多种抗菌肽[57]。菌群与上皮的黏附作用能够刺激上皮细胞产生TNF-α，并激活肠上皮的TLRs和NODs[58]；同时诱导肠上皮细胞上调血清淀粉样蛋白A的合成，激活固有层的DC细胞[59]。SCFAs刺激肠上皮细胞以GPR41和GPR43依赖性方式，激活ERK1/2和p38MAPK信号通路，从而产生炎性因子和趋化因子[60]。

4 中药干预对于肠道菌群及免疫功能的影响

以往大量研究都已证明中药有调控肠道菌群的功能，口服的中药制剂能直接与肠道菌群接触并发挥所用。近来研究进一步深入，发现除了直接作用外，中药还能够通过影响免疫系统间接调控菌群，从不同层面共同起到调节肠道菌群结构、阻止肠道菌群移位、改善肠道菌群功能的作用[61,62]。郑彦懿等[63]发现大黄牡丹汤通过抑制肠道菌群SCFAs的分泌调整肠道菌群平衡。孙必强等[64-66]发现七味白术散能迅速增加小鼠肠道中特定菌群菌量、改善肠组织微结构并影响SIgA、TNF和IL含量。吴佳伟[67]证实大黄酸通过改变小鼠肠道菌群结构、降低肠道内尿酸水平、提高SCFAs的产生来保护肠道黏膜屏障。刘锦等[68]证实大黄附子汤加味可调节脓毒症胃肠功能障碍的肠道菌群与肠道免疫异常，发挥治疗脓毒症的作用。除了局部疾病，许多研究也证实了中药具有通过肠道菌群影响免疫系统进而治疗其他系统疾病的功能，如以鳖甲煎丸治疗非酒精性脂肪肝[69]、理肺汤干预慢阻肺[70]等。同时中药的作用也与肠道菌群密不可分，目前已经发现肠道菌群能促进许多中药成分如黄芩苷等的代谢与吸收[71]。

5 总结

肠道菌群与肠道免疫之间的作用机制的在近年取得了一定的进展，为诸多疾病，尤其是免疫性疾病的发病机制填补了一些空白，并为治疗提供了新的思路。对肠道菌群与免疫的研究，也为研究中医药提供了新的落脚点与思路。目前研究中药复方被广泛采用的血清药理学，即是日本学者在研究肠道菌群的过程中提出的，以黑箱理论的形式避开复杂的内部成分，直接研究药物的总体效应，证明了中医药的有效性[72]。此外，随着脑肠轴、肝肠轴、肺肠轴、黏膜共同免疫等概念的提出，对于机体各系统之间联系研究的深入，很多现有结论与中医的传统理论相呼应。一方面从微观角度解释了经典理论的内在机理。另一方面提示我们是否能继续从一些经过临床验证的经典理论入手，指导科研的探索，做到推陈出新。

尽管目前在各个方面已经取得了很多成果，仍有一些问题亟须解决：(1)16SrRNA基因测序受制于从样本中获得的DNA及其PCR效果，考虑到肠道菌群群落的繁杂，当下对于肠道菌群的认识仍十分有限；(2)大部分研究成果来自于实验动物，不同物种间的肠道菌群具有差异，其机制是否与人体一致仍需进一步证实；(3)中药目前仍是以复方作为主要的治疗手段，血清药理学虽然证明了其有效性与整体的作用机制，对于黑箱中具体机理的研究仍不够深入。但随着相关学科的进步与实验方法的改进，相信这些问题能得到妥善解决。届时，分析菌群对协助疾病的诊断治疗与推进中医药现代化将具有重大意义。