缝隙连接细胞间通讯在丙戊酸诱导大鼠脂肪源干细胞向许旺细胞分化中的作用

吴飞，焦传杰，杨越，刘丰，孙志博

丙戊酸是经典的抗癫痫药，本课题组前期研究显示其具有神经元保护作用[1,2]，并能有效地诱导大鼠脂肪源干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs）向许旺细胞分化[3]，但其具体的调控机制尚不清楚。本研究旨在探讨缝隙连接细胞间通讯在丙戊酸诱导ADSCs 向许旺细胞分化中的作用，以进一步阐明其在神经诱导中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

DMEM 培养基、胎牛血清购于GIBCO公司，油酸酰胺、丙戊酸钠、胰蛋白酶、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购于美国Sigma 公司，兔抗鼠神经组织蛋白S100、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、巢蛋白（Nestin）、缝隙连接蛋白43（Connexin 43，Cx43）抗体购于Santa Cruz公司，RT-PCR试剂盒购于TOYOBO公司，2×Taq PCR MasterMix购于Fermentas公司，羊抗兔IgG、BCA蛋白浓度测定试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠ADSCs 的分离、培养、鉴定 取4 周龄SD大鼠10只，无菌取出适量的背部皮下脂肪，PBS漂洗，剪碎，用0.075% I 型胶原酶消化30 min，等量低糖DMEM 培养基终止消化，1500 r/min 离心10 min 后弃上清，以DMEM完全培养基重悬细胞，种于培养瓶内，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。每2天换液1次，细胞接近融合状态时，以0.25%胰酶消化、传代，取第3 代细胞进行后续实验。

1.2.2 诱导大鼠ADSCs 向许旺细胞分化 以含10 ng/mL 碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的培养液预诱导24 h，再用PBS 液漂洗，根据分组情况，将ADSCs分别用不含丙戊酸（A组）、含1.0 mmol/L丙戊酸（B组）、1.0 mmol/L丙戊酸+2.5 μmol/L油酸酰胺（C组）的诱导液培养7 d，每隔24 h换液。

1.2.3 MTT法检测各组细胞增殖情况 调整细胞浓度为5×104/mL，接种至96孔板，每组各10孔。在24、48、72 h这3个时间点每孔各加入20 μL MTT溶液，孵育4 h离心后弃上清，加入150 μL DMSO，在波长490 nm 下使用酶联免疫检测仪记录各孔吸光值。

1.2.4 免疫细胞化学染色 将ADSCs用4%多聚甲醛固定1 h，然后PBS 漂洗，3% 双氧水甲醛浸泡15 min以灭活过氧化物酶；PBS 漂洗后滴入山羊血清封闭液10 min；再分别加入S100 一抗（1:500）、NSE 一抗（1∶500）、Nestin 一抗（1∶200）、Cx43 一抗（1∶200）后于4 ℃下孵育过夜；PBS 漂洗后加入生物素化二抗，37℃孵育1 h；SABC孵育，DAB显色，苏木素复染。封片后置于倒置显微镜下观察。

表1 实时定量PCR引物序列

1.2.5 实时定量PCR 检测 根据GenBank 公布的S100、NSE、Nestin 及Cx43 的cDNA 序列，采用Primer Premier 6.0软件设计引物序列，由Invitrogen公司合成，引物序列见表1。提取各组细胞的总RNA，行RT-PCR。然后行荧光实时定量反应，结果表示为2（—△△Ct）。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0 软件处理数据。符合正态分布以及方差齐性的计量资料以（±s）表示，组间比较采用方差分析及LSD检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADSCs形态学观察

原代培养6 h后显微镜下可见细胞贴壁生长，呈圆形分布；24 h后贴壁细胞变成短梭形，见图1A；传代后大部分细胞呈长梭形，增殖迅速，3 d后达85%融合，见图1B、C。

图1 大鼠ADSCs形态学观察（光学显微镜，×200）

2.2 各组ADSCs增殖能力比较

MTT 检测显示，在3 个不同的时间点，3组细胞的增殖能力差异无统计学意义（P＞0.05），提示2.5 μmol/L油酸酰胺无明显的细胞毒作用，见图2。

图2 培养24、48、72 h后各组细胞增殖能力比较（MTT法）

2.3 各组S100、NSE、Nestin及Cx43蛋白表达水平比较

免疫细胞化学染色示，3组均有S100、NSE 和Nestin阳性细胞，B、C组S100、NSE、Nestin平均光密度值显著高于A组（P＜0.01），C组低于B组（P＜0.01）；3组均有Cx43 阳性细胞，B、C组Cx43 平均光密度值显著高于A组，B、C组之间差异无统计学意义（P＞0.05），见表2、图3。

表2 各组S100、NSE、Nestin及Cx43免疫细胞化学染色光密度值比较（±s）

表2 各组S100、NSE、Nestin及Cx43免疫细胞化学染色光密度值比较（±s）

注：与A组比较，①P＜0.01；与B组比较，②P＜0.01

组别A组B组C组例数555 S1000.1068±0.00980.2355±0.0224①0.1653±0.0183①②NSE 0.1352±0.01360.3176±0.0362①0.2158±0.0212①②组别A组B组C组Nestin 0.1613±0.01730.3578±0.0284①0.2361±0.0146①②Cx430.1206±0.01020.2102±0.0185①0.2031±0.0146①

图3 免疫细胞化学染色检测各组S100、NSE、Nestin、Cx43蛋白表达（光学显微镜，×200）

2.4 各组S100、NSE、Nestin 及Cx43 mRNA 转录水平比较

实时定量PCR 检测结果显示，B、C组S100、NSE、Nestin mRNA 转录水平显著高于A组（P＜0.01），C组低于B组（P＜0.01）；B、C组Cx43mRNA 转录水平显著高于A组（P＜0.01），B、C组之间差异无统计学意义（P＞0.05），见表3、图4。

表3 各组S100、NSE、Nestin、Cx43 mRNA转录水平比较（±s）

表3 各组S100、NSE、Nestin、Cx43 mRNA转录水平比较（±s）

注：与A组比较，①P＜0.01；与B组比较，②P＜0.01

组别A组B组C组例数101010 S1001.00±0.105.86±0.52①2.46±0.31①②NSE 1.00±0.107.02±1.15①2.94±0.46①②组别A组B组C组Nestin 1.00±0.107.53±1.22①3.51±0.37①②Cx431.00±0.108.32±1.87①8.56±1.53①

图4 实时定量PCR测定各组S100、NSE、Nestin、Cx43mRNA转录水平

3 讨论

丙戊酸是一种广谱抗癫痫药，具有分子量小、易透过血脑屏障、人体吸收快、体内有效血浓高、毒副作用少、价格低廉等优点。研究发现丙戊酸可显著促进大鼠有髓神经纤维再生[4]。本课题组前期研究发现丙戊酸具有促雪旺细胞增殖和髓鞘化的类神经营养特性[5]。与其他的神经营养因子如神经生长因子、脑源性神经生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子相比较，丙戊酸具有快速通过血脑屏障、较长的生物半衰期及较高的临床安全性等优点。此外，本课题组以乳酸-羟基乙酸-L-赖氨酸多肽接枝聚/聚乳酸/纳米羟基磷灰石作为载体复合丙戊酸，构建可缓释丙戊酸的神经导管，成功地促进了大鼠的外周神经再生[6,7]。然而关于丙戊酸促进神经再生的作用机制目前尚不清楚。

缝隙连接广泛存在于中枢神经系统中，由细胞间的两个半通道桥接组成，该通道由具有多肽链结构的连接蛋白单体构成。它传递着不同神经细胞间的电化学信息，允许离子、代谢物、小分子物质通过，对神经发育及神经功能维持具有重要的调控作用[8]。缝隙连接细胞间通讯经常受到病理和药物因素的影响，油酸酰胺作为常用的缝隙连接脱耦联剂，能够有效地抑制缝隙连接[9]。本研究应用低浓度（2.5 μmol/L）的油酸酰胺来抑制缝隙连接通讯，MTT 试验表明该浓度油酸酰胺对ADSCs 增殖未产生影响，无明显细胞毒作用。

本实验采用1.0 mmol/L 丙戊酸在体外诱导ADSCs 分化。免疫细胞化学和实时荧光定量PCR 检测显示B组细胞高表达许旺细胞特异标记物S100、NSE 和神经干细胞特异标志物Nestin；经油酸酰胺干预后C组细胞的S100、NSE、Nestin 表达水平显著下调；而B组和C组的Cx43 表达均显著增加；这提示丙戊酸可有效地诱导ADSCs分化为类许旺细胞，其作用能够被油酸酰胺显著抑制。

本研究创新性地指出缝隙连接细胞间通讯在丙戊酸诱导ADSCs神经分化中的重要性，从基因和蛋白水平证实丙戊酸通过上调Cx43表达来诱导ADSCs向许旺细胞分化，该分化可被油酸酰胺干预显著抑制，这提示油酸酰胺可能通过阻断缝隙连接细胞间通讯抑制丙戊酸的神经诱导分化作用。本研究中，丙戊酸明显上调Cx43表达，油酸酰胺在抑制丙戊酸的诱导分化作用的同时对Cx43 表达却没有影响，这可能是通过影响Cx43的翻译后修饰来发挥效应，具体机制尚有待进一步研究。