吉林省西瓜蔓枯病菌对咪鲜胺和苯醚甲环唑敏感基线的建立和抗性监测

孙东晗 陈悦 田文学 白庆荣 赵廷昌

摘要 ：为明确吉林省西瓜蔓枯病菌Stagonosporopsis citrulli对咪鲜胺和苯醚甲环唑的抗药性水平，本试验采用菌丝生长速率法测定了151株西瓜蔓枯病菌对这两种药剂的敏感性及两种药剂对西瓜蔓枯病菌的MIC值，并测定了吉林省7个西瓜主产区的375株菌株对这两种药剂的抗性水平。结果表明，供试的151株菌株对这两种药剂的敏感性频率分布均呈连续的单峰曲线，接近正态分布;对咪鲜胺和苯醚甲环唑的敏感基线分别为（0.203 0±0.135 3）μg/mL和（0.675 9±0.394 2）μg/mL;两种药剂的最低抑制浓度MIC分别为20 μg/mL和40 μg/mL。供试375株菌株对两种杀菌剂的抗性频率均为0。本研究结果为咪鲜胺和苯醚甲环唑的合理用药策略提供了科学依据，为后续其抗性风险评估奠定了基础。

关键词 ：西瓜蔓枯病菌; 抗药性; 咪鲜胺; 苯醚甲环唑

中图分类号：

S 482.2

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020494

Establishment of baseline sensitivity and monitoring of resistance

of Stagonosporopsis citrulli on watermelon to prochloraz

and difenoconazole in Jilin province

SUN Donghan1， CHEN Yue1， TIAN Wenxue2， BAI Qingrong1*， ZHAO Tingchang3*

（1.College of Plant Protection， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China; 2.Shandong

Sino-Agri United Biotechnology Co.，Ltd.， Jinan 250100， China; 3.Institute of Plant

Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

To evaluate the resistance levels of Stagonosporopsis citrulli causing gummy stem blight of Citrullus lanatus in Jinlin province to prochloraz and difenoconazole， the baseline sensitivities of S.citrulli strains （n=151） to the two fungicides and the minimum inhibitory concentrations （MICs） of the two fungicides to S.citrulli strains were determined by using mycelial growth rate method.The resistance levels of 375 stains from seven main watermelon production areas of Jinlin province to two fungicides were also determined.The results showed that the sensitivity frequency distribution of tested strains（n=151） to prochloraz and difenoconazole presented continuous single peak curves， which were close to normal distribution.The baseline sensitivities of S.citrulli strains to prochloraz and difenoconazole were （0.203 0±0.135 3）μg/mL and （0.675 9±0.394 2）μg/mL， respectively.The MICs of prochloraz and difenoconazole were 20 μg/mL and 40 μg/mL， respectively.The resistance frequencies of 375 tested strains to the two fungicides were both zero.The results provided a scientific basis for rational application of prochloraz and difenoconazole， and laid a foundation for the subsequent study on the resistance risk assessment.

Key words

Stagonosporopsis citrulli; fungicide resistance; prochloraz; difenoconazole

西瓜蔓枯病主要是由Stagonosporopsis citrulli引起的世界性病害，在西瓜整个生育期均可发病，危害西瓜叶片、茎秆、藤蔓和果实[12]。在适宜的温度和湿度条件下，可迅速发展蔓延，大田种植时发病率可达20%～40%，溫室种植和连作时更可达80%，如管理不当常常会造成毁灭性的损失，严重影响西瓜的品质和产量[34]。目前关于西瓜蔓枯病的防治措施仍是以化学防治为主，咪鲜胺和苯醚甲环唑对该病害具有见效快，防治效率高等优势，备受瓜农青睐[56]。2019年对吉林省西瓜蔓枯病菌的优势种Stagonosporopsis citrulli进行了室内药剂敏感性的测定，试验结果表明病菌对咪鲜胺和苯醚甲环唑表现出了较高的敏感性。

自2005年首次报道水稻恶苗病菌对咪鲜胺出现抗性菌株，且抗性频率为1.46%[7]，至今一些地区因不科学地使用咪鲜胺，使得水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae [8]、菜心炭疽病菌Colletotrichum higginsianum [9]、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum [10]和玉米小斑病菌Bipolaris maydis [11]等已对其产生抗药性，但其中未有西瓜蔓枯病菌对咪鲜胺抗药性方面的相关报道。刘顺涛等对重庆、贵州地區西瓜蔓枯病菌对苯醚甲环唑的抗性研究结果表明，该地区仍以敏感菌株为主，但在重庆武隆和贵州息烽发现6株抗性菌株，抗性频率为2.88%[12]。

咪鲜胺和苯醚甲环唑目前广泛用于吉林省西瓜蔓枯病的防治，且用药量较大，因此本研究对吉林省西瓜蔓枯病菌优势菌株对咪鲜胺和苯醚甲环唑抗药性进行监测，为制定合理的用药策略提供科学依据，也为后续研究西瓜蔓枯病菌对上述两种药剂的抗性风险评估奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

2018年-2019年连续两年，在吉林省农安县、乾安县、长岭县、通榆县、洮南市、梨树县和双辽市7个西瓜主产区采集具有西瓜蔓枯病症状的样本，通过组织分离法共获得526株菌株，经三重PCR鉴定确认为西瓜蔓枯病菌优势种S.citrulli。从中随机挑选151株用于敏感基线的建立以及MIC值的确定，其余375株用于抗药性监测。

1.1.2 供试药剂

98%咪鲜胺原药（江苏辉丰股份有限公司）和96%苯醚甲环唑原药（山东省联合农药工业有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 含药培养基的配制

将供试药剂均溶于丙酮，配制成1×104μg/mL的母液，于4℃冰箱贮存，备用[13]。

将母液用无菌水以10倍为梯度，依次稀释成1×103、1×102、1×101、1、1×10-1μg/mL的药液。再将PDA培养基与制好的药液按体积比9∶1混合均匀制成不同浓度的含药平板。

1.2.2 西瓜蔓枯病菌对咪鲜胺和苯醚甲环唑的敏感性测定

将供试菌株在PDA平板上培养4 d后，用灭菌的移液枪枪头在菌落边缘打取8 mm的菌饼移至含药浓度分别为1×102、1×101、1、1×10-1、1×10-2μg/mL的PDA培养基中央，每个浓度处理重复3次，以加等量无菌水的正常PDA培养基作为空白对照，在25℃恒温、全光照、30% RH条件下培养至对照菌落直径为培养皿直径的2/3时，采用十字交叉法测量菌落直径。

利用VBA软件计算出药剂对病原菌的毒力回归方程y=a+bx，相关系数（r）以及有效抑制中浓度（EC 50）值。

用SPSS软件绘制西瓜蔓枯病菌对咪鲜胺和苯醚甲环唑的敏感性频率分布图，根据野生敏感型病原群体对药剂敏感性为正态分布的原理，确认病原菌群体EC 50敏感性频率分布是否呈正态分布或连续的单峰曲线，如果呈正态分布或连续的单峰曲线，就可将其群体EC 50均值作为病原菌对药剂的敏感基线[14]。

1.2.3 咪鲜胺和苯醚甲环唑对西瓜蔓枯病菌MIC值的确定及抗性监测

将1.2.2中测定过EC 50的151株敏感菌株按相同方法制成8 mm菌饼，移至含咪鲜胺和苯醚甲环唑浓度均为10、20、30、40、50 μg/mL的PDA培养基中央，于25℃恒温，全光照，30%RH培养，每个浓度处理均设3次重复。培养4 d后，观察菌丝生长情况，将所有菌株均不能生长的最低浓度确认为咪鲜胺和苯醚甲环唑对西瓜蔓枯病菌敏感菌株的最低抑制浓度即MIC（minimal inhibition concentration）。

将2018年-2019年采自吉林省7个县市的375株西瓜蔓枯病菌菌株活化培养后，按1.2.2中方法制成菌饼分别移至含最低抑制浓度20 μg/mL咪鲜胺和40 μg/mL苯醚甲环唑的PDA培养基上，以含等量无菌水的PDA培养基作为空白对照，均设3次重复，在25℃恒温，全光照，30%RH条件下培养4 d后，观察菌丝生长情况划分抗性类型，并计算其抗性频率。

抗性频率=（抗性菌株数/总菌株数）×100%。

2 结果与分析

2.1 吉林省西瓜蔓枯病菌对咪鲜胺的敏感基线及抗性监测

2.1.1 西瓜蔓枯病菌对咪鲜胺的敏感基线

咪鲜胺对吉林省西瓜主产区西瓜蔓枯病菌S.citrulli的EC 50范围为0.059 3～0.590 7 μg/mL（表1）。不同地点的EC 50范围：松原市乾安县0.086 9～0.578 4 μg/mL，长岭县0.077 0～0.590 7 μg/mL;白城市洮南市0.064 7～0.535 8 μg/mL，通榆县0.066 9～0.543 4 μg/mL;四平市双辽市0.059 3～0.503 5 μg/mL，梨树县0.079 3～0.536 6 μg/mL;长春市农安县0.072 0～0.469 0 μg/mL。咪鲜胺对7个县市西瓜蔓枯病菌的EC 50没有显著性差异，其中EC 50最小值为0.059 3 μg/mL，最大值为0.590 7 μg/mL，相差9.96倍。

根据测定的151株菌株对咪鲜胺的敏感性，绘制西瓜蔓枯病菌对咪鲜胺的敏感性分布图（图1）。其平均值为（0.203 0±0.135 3）μg/mL。供试的151株西瓜蔓枯病菌对咪鲜胺的敏感性频率分布呈近似正态的单峰曲线，因此可将其EC 50平均值作为吉林省西瓜蔓枯病菌对咪鲜胺的敏感基线。

2.1.2 咪鲜胺对西瓜蔓枯病菌MIC值的确定及抗性监测

通过菌丝生长速率法测定咪鲜胺对供试151株菌株的MIC值，确定其范围在10～20 μg/mL之间。结合其敏感基线以及测得的MIC值，将20 μg/mL作为区分吉林省西瓜蔓枯病菌对咪鲜胺的抗性或敏感的浓度，即不能在含20 μg/mL咪鲜胺的PDA平板上生长的为敏感菌株。测定2018年-2019年采自吉林省的375株西瓜蔓枯病菌对咪鲜胺均敏感，未监测到抗药性菌株，抗性频率为0（表2）。

2.2 吉林省西瓜蔓枯病菌对苯醚甲环唑的敏感基线及抗性水平

2.2.1 西瓜蔓枯病菌对苯醚甲环唑的敏感基线

苯醚甲环唑对吉林省西瓜蔓枯病菌的EC 50范围为0.162 2～1.563 0 μg/mL。如表3所示，按地区划分其EC 50分别为：松原市乾安县0.392 8～1.376 5 μg/mL，长岭县0.209 6～1.478 5 μg/mL;白城市洮南市0.230 4～1.465 1 μg/mL，

通榆县0.163 7～1.465 2 μg/mL;四平市双辽市0.173 9～1.563 0 μg/mL，梨树县0.287 8～1.497 6 μg/mL;長春市农安县0.162 2～1.325 8 μg/mL。苯醚甲环唑对7个县市西瓜蔓枯病菌的EC 50没有显著性差异，其中EC 50最小值为0.162 2 μg/mL，最大值为1.563 0 μg/mL，相差9.64倍。

根据测定的151株供试菌株对苯醚甲环唑的敏感性，绘制西瓜蔓枯病菌对苯醚甲环唑的敏感性频率分布图（图2），其平均值为（0.675 9±0.394 2）μg/mL。供试的151株西瓜蔓枯病菌对苯醚甲环唑的敏感性频率分布呈近似正态的单峰曲线，因此可将其EC 50平均值作为吉林省西瓜蔓枯病菌对咪鲜胺的敏感基线。

2.2.2 苯醚甲环唑对西瓜蔓枯病菌MIC值的确定及抗性监测

通过菌丝生长速率法测定苯醚甲环唑对供试151个菌株的MIC值在30～40 μg/mL之间，再结合其敏感基线，将40 μg/mL作为区分吉林省西瓜蔓枯病菌对苯醚甲环唑的抗性或敏感的浓度，即不能在含40 μg/mL苯醚甲环唑的PDA平板上生长的为敏感菌株。2018年-2019年采自吉林省的375株西瓜蔓枯病菌对苯醚甲环唑均敏感，未监测到田间抗性菌株，田间抗性频率为0（表4）。

3 结论与讨论

西瓜蔓枯病是西瓜生产上的重要病害之一，目前仍以化学防治为主。近年来，咪鲜胺与苯醚甲环唑广泛用于吉林省西瓜主产区西瓜蔓枯病的防治。及时了解西瓜蔓枯病菌对咪鲜胺和苯醚甲环唑的抗药性对药剂的合理使用尤为重要。本试验测定了吉林省7个西瓜主产区中151株西瓜蔓枯病菌对咪鲜胺和苯醚甲环唑的敏感性。咪鲜胺对西瓜蔓枯病菌的EC 50为0.059 3～0.590 7 μg/mL，苯醚甲环唑对西瓜蔓枯病菌的EC 50为0.162 2～1.563 0 μg/mL，虽然不同菌株之间存在敏感性差异，但EC 50范围相对较窄，且最大值与最小值相差倍数分别为9.96和9.64，说明这两种杀菌剂对西瓜蔓枯病菌具有很高的抑制活性。

所测定的151株西瓜蔓枯病菌对咪鲜胺和苯醚甲环唑的敏感性频率均呈近似正态分布的单峰曲线，病菌对咪鲜胺的敏感基线为（0.203 0±0.135 3）μg/mL，对苯醚甲环唑的敏感基线为（0.675 9±0.394 2）μg/mL。咪鲜胺和苯醚甲环唑对151株西瓜蔓枯病菌的MIC值分别为10～20 μg/mL及30～40 μg/mL，结合相应敏感基线，确定20 μg/mL和40 μg/mL分别作为吉林省西瓜蔓枯病菌对咪鲜胺和苯醚甲环唑的抗性监测标准浓度。监测了吉林省西瓜主产区375株西瓜蔓枯病菌对两种药剂的抗药性，均未发现抗药性菌株，抗性频率为0。

刘顺涛等报道重庆武隆、贵州息烽出现少量对苯醚甲环唑敏感性下降的亚群体，表现为低抗和中抗[12]。目前吉林省内尚未发现对苯醚甲环唑产生抗药性的西瓜蔓枯病菌菌株，可能与药剂使用年限较短，用药水平不高有关。祁之秋等报道脱甲基抑制剂（咪鲜胺）抗性发展缓慢，但长期使用也会出现抗药性[15]。因此，应加强定期抗性监测工作，及时了解病原菌敏感性变化动态，科学应用咪鲜胺和苯醚甲环唑，以延缓病原菌对其产生抗药性，从而延长咪鲜胺和苯醚甲环唑的使用年限且保证高效性。

通过对吉林省西瓜蔓枯病菌的抗药性监测来掌握该病原菌对咪鲜胺和苯醚甲环唑敏感性的基础数据及抗药性，也为西瓜蔓枯病菌对咪鲜胺和苯醚甲环唑的抗药性风险评估奠定基础。

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（责任编辑：田 喆）