PIAS1对裸鼠胃癌种植瘤模型肿瘤细胞增殖的影响及机制研究

陈 平 忻笑容 谢 玲 周郁芬 吴云林

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，对进展期患者的治疗是重点和难点，较差的预后严重影响了患者的生存时间，因此有必要深入认识胃癌的进展机制，从而改进治疗策略。目前国内关于胃癌组织中的巨噬细胞与患者临床病理学特征关系的研究较多，相关报道指出巨噬细胞浸润程度越高，患者的总体生存期越短，主要原因涉及巨噬细胞的M1/M2型的漂移转换，尤其是在肿瘤微环境中巨噬细胞可转换为促肿瘤生长的M2型，而从M2型转变为M1型，所诱导的固有免疫反应可使肿瘤体积缩小[1-2]。因此，通过炎性微环境调控肿瘤的进展对疾病的治疗具有重要意义。

信号转导与转录激活子1(STAT1)的活化抑制蛋白(PIAS1)是Janus激酶(JAK)/STAT信号通路的负性调控家族成员之一，有报道指出PIAS1可抑制免疫调节基因生成，参与负性调控炎性反应，预防炎性反应过度，认为PIAS1可能是抗炎性反应枢纽蛋白之一[3]。国内研究发现，PIAS1可通过SUMO化修饰调控原癌基因网络而发挥治疗作用[4]。本课题组前期研究发现，PIAS1作为参与调控炎性反应的因子，在胃炎患者中呈高表达，但在胃癌患者中呈低表达，并与胃癌的分期有关，提示PIAS1可能与疾病的预后相关[5]，但具体的分子机制还有待进一步阐明。基于上述结果，本研究为了更好地认识PIAS1在胃癌中的作用及相关机制，探索了PIAS1的表达水平在活体内对胃癌细胞增殖的影响，并揭示了其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

人胃癌细胞株SGC-7901、293T细胞和慢病毒载体均由上海齐合生物技术有限公司制备并提供使用，质粒抽提试剂盒购自德国QIAGEN公司，Lipofactamine 2000购自美国Gibco公司，抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体、抗低氧诱导因子-1α(HIF-1α)抗体、抗CD34抗体和抗F4-80抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 LV-EGFP-PIAS1转染胃癌细胞株SGC-7901

构建PIAS1全序列信使RNA(mRNA)的慢病毒质粒，表示为LV-EGFP-PIAS1-mRNA。先进行293T细胞培养和293T细胞接种，其后构建LV-EGFP-PIAS1-mRNA转染293T细胞。主要步骤包括应用500 μL Optimum和14.18 μL Lipofactamine 2000混匀，室温下静置5 min，将500 μL Optimum、1.7 μg 慢病毒载体、1.13 μg PIAS1和0.57 μg MD2.G混匀配制成DNA混合物，然后与静置5 min的Optimum和Lipofactamine 2000混匀，室温下静置20 min后，将混匀的混合物加入培养基中。6 h后将培养基更换为含10% FBS无抗生素的H-DMEM完全培养基，在细胞转染完成后的48 h、72 h和96 h分别收集上清液，于-80℃保存行病毒收集，选择胃癌细胞株SGC-7901进行LV-EGFP-PIAS1-mRNA细胞转染，其后筛选LV-EGFP-PIAS1转染成功的SGC-7901细胞。

1.3 Western blotting检测细胞PIAS1蛋白表达

收集LV-EGFP-PIAS1转染及对照(经PBS处理)SGC-7901细胞，提取总蛋白，取4 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝浆电泳后，将蛋白转移至PVDF膜，PVDF膜经5%脱脂奶粉封闭后，与抗PIAS1多克隆抗体(1∶100)混合，4 ℃摇床过夜，之后滴加辣根过氧化物酶标记的IgG(1∶1 000)，于室温下摇床孵育1 h，采用ECL发光液显影，GAPDH作为对照，观察显影强度。

1.4 细胞增殖检测

LV-EGFP-PIAS1转染、LV-EGFP-native空白和经PBS处理(对照)的SGC-7901细胞分别经0.25%含EDTA的胰酶消化后，记录为LV-EGFP-PIAS1转染组、LV-EGFP-native空白组和对照组，用含10% FBS的完全培养基终止消化，重悬为单个细胞并计数为1.4×103个细胞后，接种于100 μL的DMEM完全培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中，分别在培养1 d、2 d、3 d、4 d和5 d后加入10 μL MTT，孵育3 h后行MTT实验，然后使用酶标仪测定吸光度值。

1.5 裸鼠胃癌种植瘤模型制备

LV-EGFP-PIAS1转染、LV-EGFP-native空白和经PBS处理(对照)的SGC-7901细胞分别经胰酶消化变圆后，用完全培养基终止消化，于800 r/min离心5 min，弃上清，用预冷的1×PBS重悬细胞，同样于800 r/min离心5 min，再次弃上清，用预冷的1×PBS重悬细胞，调整细胞密度为5×107个/mL；在每只裸鼠的肋部皮下接种5×106个细胞，遵循随机、对照、配对原则将36只裸鼠分为3组，每组12只，记录为LV-EGFP-PIAS1转染组、LV-EGFP-native空白组和对照组；每3～4天，用游标卡尺测量皮下肿瘤的长、宽并记录；第21天对裸鼠实施安乐死，按组摆放，拍外观照；取下肿瘤，按组摆放并拍照后，于4%的多聚甲醛中浸泡保存，制备蜡块。

1.6 免疫组织化学检测

不同处理组裸鼠模型分别采用免疫组织化学S-P法(S-P试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司)进行检测，组织标本常规使用甲醛溶液固定，4 h内取材，石蜡包埋后行连续切片(厚度为4 μm)，在组织切片中加入0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液后，置于微波炉加热，修复抗原；分别加入兔抗PCNA抗体(1∶1 000)、抗HIF-1α抗体(1∶600)、抗CD34抗体(1∶600)、抗F4-80抗体(1∶600)稀释液后，4 ℃下置于湿盒内孵育过夜；加入生物素标记的二抗，37 ℃湿盒内孵育20 min；加入S-P工作液，37 ℃孵育20 min。其后，为便于肿瘤微环境转移(TMEM)检测，组织采用双标法染色技术，CD34采用DAB显色，以细胞膜呈现黄色颗粒为阳性；F4-80采用AEC显色，以细胞膜呈现蓝色为阳性。此外，PCNA和HIF-1α采用DAB显色，以细胞核呈现黄色颗粒为阳性，苏木精复染色。免疫组织化学检测的操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

PCNA和HIF-1α的染色结果以染色强度和阳性细胞所占的百分比进行综合判断，高倍镜下取500个细胞，染色强度以大多数细胞的呈色反应为准。染色强度：浅棕色计1分，棕黄色计2分，深棕色计3分，不着色计0分。染色阳性细胞的百分比：阴性计0分，<10%计1分，11%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分。根据染色强度和阳性细胞百分比的乘积分数将染色结果分为4个等级： 0～2分为阴性(-)、3～4分为弱阳性(+)、5～8分为阳性(++)、9～12分为强阳性(+++)。

TMEM的判断标准：参照Robinson等[6]的研究方法，低倍镜下观察整张切片，避开坏死、炎性反应及假像部位(如皱褶、折叠)，低倍镜下选取肿瘤细胞富集区域，然后在高倍镜(每个视野面积为0.785 mm2)下计数10个视野的TMEM，取其总和作为该例的TMEM值。TMEM由巨噬细胞、血管内皮细胞和肿瘤细胞直接相邻组成，若巨噬细胞与肿瘤细胞之间有纤维间隔，或者巨噬细胞与血管内皮细胞不相邻者均不计算在内。

1.7 统计学方法

应用SPSS 13.0软件进行数据分析。计量资料数据采用均数±标准差表示，采用通用线性模型，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。计数资料采用百分比表示，组间比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PIAS1转染效率测定

选取LV-EGFP-PIAS1转染组和对照组，转染24 h后采用Western blotting法测定两组PIAS1蛋白的表达水平，以评估转染效率。如图1所示，与对照组相比，LV-EGFP-PIAS1转染组的PIAS1蛋白表达水平显著升高。

图1 PIAS1蛋白在LV-EGFP-PIAS1转染组和对照组中的表达

2.2 细胞增殖率测定

转染24 h后测定各组细胞增殖率，结果显示LV-EGFP-PIAS1转染组的细胞增殖率为(58.17±4.10)%，低于LV-EGFP-native空白组[(70.23±8.75)%]和对照组[(73.99±6.94)%]，且差异均有统计学意义(P均<0.05)，而LV-EGFP-native空白组与对照组间细胞增殖率的差异无统计学意义(P=0.352)。

2.3 裸鼠胃癌种植瘤模型制备

所有裸鼠均成活并有肿瘤形成，部分裸鼠接种处皮肤有红肿及破溃表现(见图2)。接种第21天，LV-EGFP-PIAS1转染组的成瘤体积为(0.74±0.20)cm3，小于LV-EGFP-native空白组(1.26±0.23 cm3)和对照组(1.31±0.30 cm3)，且差异均有统计学意义(P均<0.05)；而LV-EGFP-native空白组与对照组间成瘤体积的差异无统计学意义(P=0.796)。

图2 不同处理组的裸鼠种植瘤体积比较 A LV-EGFP-native空白组 B LV-EGFP-PIAS1转染组 C 对照组

2.4 PCNA在胃癌种植瘤中的表达

由图3染色结果可知，PCNA在组织细胞中呈现棕黄色至深棕色；在对照组和LV-EGFP-native空白组中，染色面积较广泛，而LV-EGFP-PIAS1转染组中染色面积较小。如表1所示，LV-EGFP-PIAS1转染组中PCNA的阳性表达率为66.6%(8/12)，低于LV-EGFP-native空白组(91.6%)和对照组(100.0%)，差异均有统计学意义(P均<0.05)；而LV-EGFP-native空白组与对照组的PCNA阳性表达率差异无统计学意义(P=0.783)。

图3 各组裸鼠种植瘤组织中PCNA表达的免疫组织化学检测结果 DAB显色 ×200 A LV-EGFP-native空白组 B LV-EGFP-PIAS1转染组 C 对照组

表1 各组裸鼠种植瘤组织中PCNA的阳性表达率/例

2.5 HIF-1α在胃癌种植瘤中的表达

由图4染色结果可知，HIF-1α在组织细胞中呈现棕黄色至深棕色；在对照组和LV-EGFP-native空白组中，染色面积较广泛，而在LV-EGFP-PIAS1转染组中染色面积较小。如表2所示，LV-EGFP-PIAS1转染组中HIF-1α的阳性表达率为50.0%(6/12)，低于LV-EGFP-native空白组(83.3%)和对照组(91.6%)，且差异均有统计学意义(P均<0.05)；而LV-EGFP-native空白组与对照组的HIF-1α阳性表达率差异无统计学意义(P=0.935)。

图4 各组裸鼠种植瘤组织中HIF-1α表达的免疫组织化学检测结果 DAB显色 ×200 A LV-EGFP-native空白组 B LV-EGFP-PIAS1转染组 C 对照组

表2 各组裸鼠种植瘤组织中HIF-1α的阳性表达率/例

2.6 各组TMEM计数情况

收集各组裸鼠种植瘤，采用免疫组织化学法检测组织标本中CD34和F4-80的表达(见图5)。行TMEM计数，结果发现LV-EGFP-PIAS1转染组平均TMEM计数为(2.83±0.93)个，少于LV-EGFP-native空白组[(3.83±0.83)个]和对照组[(3.91±0.99)个]，且差异均有统计学意义(P均<0.05)；而LV-EGFP-native空白组与对照组相比差异无统计学意义(P=0.827)。

图5 各组裸鼠种植瘤组织中CD34和F4-80表达的免疫组织化学检测结果 双标法(CD34采用DAB显色，F4-80采用AEC显色) ×200 A LV-EGFP-native空白组 B LV-EGFP-PIAS1转染组 C 对照组

3 讨论

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，在中国的肿瘤发病率中仅次于肺癌，肿瘤病死率居第3位。有研究指出肿瘤与炎性反应之间存在联系，认为慢性炎性反应是胃癌的常见诱发因素之一，在胃癌的发生、发展过程中起重要作用，相关机制认为在幽门螺杆菌等慢性炎性因素的刺激下，炎性细胞释放促炎因子，激活细胞信号转导通路，诱导胃黏膜损伤，改变了细胞生存微环境，产生一系列病理生理变化，最终促进胃癌发生[7]。STAT1信号通路除了可参与过度炎性反应过程之外，有研究提示其可广泛参与细胞的增殖、分化及免疫调节过程，参与诱导细胞周期抑制和细胞凋亡的相关因子，并作用于抗血管生成因子刺激血管生成；该研究通过基因静默及时干扰STAT1基因表达，发现可抑制胃癌细胞的生长、侵袭、迁移，提示可为胃癌的诊治提供新的契机[8]。因此，随着对STAT1信号转导通路的作用途径和激活机制不断深入了解，其负性调节因子——PIAS1已成为临床及基础研究的热点之一。

PIAS1是JAK/STAT信号通路的负性调控家族成员之一，可通过与STAT1单体或二聚体结合，阻断STAT1与DNA结合，从而发挥抑制作用，其可作为STAT1的特异性抑制因子。有报道指出，PIAS1在原发性肝癌中的阳性率和阳性表达强度均明显低于癌旁组织，且与原发性肝癌的分化程度显著相关，提示PIAS1蛋白的丢失可能参与了肿瘤的发生和进展[9]。另有研究显示，PIAS1的丢失促进了STAT1的持续激活，与淋巴瘤的发生有关[10]。已有研究指出，除了STAT1，PIAS1还能与核因子-κB亚单位p65相互作用，抑制其参与的基因转录[11]。本课题组的前期研究发现，应用腺病毒载体Ad5/F35携带PIAS1上调胃癌细胞株SGC-7901的PIAS1表达时，肿瘤细胞迁移率下降，其机制可能涉及丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路及基质金属蛋白酶9(MMP-9)的调控[12]。基于此，本研究通过慢病毒携载PIAS1基因转染胃癌细胞株SGC-7901持续性表达PIAS1，观察细胞增殖率，并在裸鼠上种植经不同方式处理的细胞株，观察活体状态下PIAS1表达对种植瘤增殖的影响及相关细胞因子的表达水平，为PIAS1治疗胃癌提供理论依据。本研究结果显示，LV-EGFP-PIAS1转染组与空白组及对照组比较，成瘤体积明显缩小，评价细胞增殖状态的指标——PCNA的表达水平显著降低。

HIF-1α是炎性诱导相关因子，可以与肿瘤细胞膜表面的糖蛋白配体相结合，通过诱导肿瘤细胞转录上游启动子激活，促进肿瘤细胞内多条信号通路激活，促进肿瘤细胞核异常分裂。有研究显示，HIF-1α可促进局部肿瘤新生毛细血管形成，提高肿瘤病灶组织的血流灌注程度，进而促进恶性肿瘤的发生、发展[13]。 有报道指出，HIF-1α的阳性表达与胃癌的发生密切相关[14]。本研究结果显示，LV-EGFP-PIAS1转染组与空白组及对照组比较，HIF-1α的表达水平降低，提示PIAS1可能参与调节HIF-1α的表达，进而影响肿瘤血管生成。肿瘤的发生、发展和复发转移不仅由恶性肿瘤细胞自身决定，而且与肿瘤微环境中的非肿瘤细胞成分(包括血管内皮细胞和巨噬细胞)密切相关。动物体内成像可观察到，侵袭性肿瘤细胞发生血管内渗现象中有肿瘤细胞与巨噬细胞之间的旁分泌环，而且肿瘤细胞只在血管周围处发生内渗，并在肿瘤细胞发生血管内渗的部位形成TMEM结构，这种由肿瘤细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞直接相邻所构成的TMEM与肿瘤的血道转移密切相关，可成为评估胃癌血道转移风险的新的预测指标[15]。本研究选用巨噬细胞抗F4-80抗体作为巨噬细胞的标志物，并测定CD34，计数血管内皮细胞数，了解各组间TMEM结构的改变，结果发现LV-EGFP-PIAS1转染组与空白组及对照组比较，TMEM表达水平降低，提示PIAS1可能参与了肿瘤微环境的调控，进而可能影响肿瘤的转移。

综上所述，PIAS1的高表达可能参与了胃癌细胞的增殖过程，可抑制肿瘤的生长和转移，其机制可能为通过调控HIF-1α而改变肿瘤的微环境结构，有望成为胃癌治疗的新靶点，但具体机制还有待进一步探索。