SEMA3E在溃疡性结肠炎组织中的表达水平及与疾病严重程度的关系

张利云 郑百战

溃疡性结肠炎(UC)是炎症性肠病常见的类型，近年来其发病率呈逐年上升趋势[1]。UC具有病程长、复发率高及并发症多的特点[2-3]，其临床表现为便血、反复发作的腹痛、高热等[4-5]。有研究指出，重度UC具有癌变的可能，随着病程延长及疾病的反复发作，患者发生癌变的风险升高[6]。因此，尽早明确UC患者的疾病严重程度，及时采取有效的干预措施，对于改善患者的预后具有重要意义。目前临床应用的指标如C反应蛋白等，评估UC疾病严重程度的特异度较低[7]，亟需探寻敏感度和特异度更高的生物学指标以准确评估UC患者的疾病严重程度。有研究表明，信号素3E(SEMA3E)基因可通过核因子-κB信号通路调节肠道免疫功能[8]。UC的发生与肠道免疫失衡关系密切，但有关SEMA3E miRNA与UC的发生、发展关系的报道较少。本研究探讨了SEMA3E miRNA与UC患者疾病严重程度的关系，以期采取有效措施改善患者的预后情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料

前瞻性选取2013年5月至2016年5月延安大学咸阳医院收治的109例UC患者作为研究对象，另选取同期在本院接受单发结肠息肉切除术的97例患者作为对照组。纳入标准：(1)符合《中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》[9]中的UC诊断标准；(2)年龄>18岁；(3)能够配合完成随访；(4)患者签署知情同意书。排除标准：(1)合并恶性肿瘤；(2)合并严重心、肝、肾功能不全；(3)伴有中毒性结肠扩张；(4)合并其他原因引起的全身感染性疾病；(5)妊娠期及哺乳期妇女。109例UC患者中男性47例，女性62例，年龄为26～57岁，平均年龄为(41.93±5.03)岁，平均体质量指数(BMI)为(21.04±3.07)kg/m2。对照组中男性50例，女性47例，年龄为28～59岁，平均年龄为(41.68±4.96)岁，平均BMI为(21.10±3.15)kg/m2。两组在性别(χ2=1.610，P=0.205)、年龄(t=0.358，P=0.720)、BMI(t=0.138，P=0.890)方面比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)，具有可比性。本研究获得医院医学伦理委员会批准(批件号YDXY-KY-2013)。

1.2 方法

抽取患者入组次日清晨空腹外周静脉血5 mL，室温下4 000 r/min离心10 min，离心半径8 cm，分离上层血清，置于-20 ℃冰箱待测。采用间接免疫荧光法检测核周型抗中性粒细胞胞浆抗体(pANCA)水平，试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司(批号E0601141201)，pANCA阳性样本逐渐稀释至1/1 024确定滴度，将滴度转换为整数：阴性=0、1/16=1、1/32=2、1/64=3、1/128=4、1/256=5、1/512=6、1/1 024=7；采用苏木精-伊红染色法检测基底浆细胞，基底浆细胞增多指黏膜下1/3浆细胞浓密渗透。采用化学发光免疫分析法检测血清白细胞介素-6(IL-6)、IL-15的表达水平，试剂盒均购自北京普朗医疗设备有限公司。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time qPCR)法检测SEMA3E miRNA的相对表达量。用液氮研磨UC患者的炎性组织及对照组的正常黏膜组织，用TRIzol试剂提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA的纯度及含量。应用核酸蛋白仪和琼脂糖凝胶电泳对提取的RNA进行分析。取总RNA 4 μL，82 ℃水浴5 min后加入反转录反应液，44 ℃孵育60 min后终止，留取产物待用。扩增条件为：95 ℃ 5 min预变性；95 ℃ 30 s、15 s退火、70 ℃ 30 s，35个循环。以GAPDH作为内参，用2-ΔΔCt表示SEMA3E miRNA的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 UC严重程度评估

根据结肠镜检查结果将UC患者分为缓解期(n=48)和活动期(n=61)。根据《中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》进行UC疾病严重程度评估[9]：轻度为每日排便次数<4次，红细胞沉降率<20 mm/h，血红蛋白、体温、脉搏等正常；中度为每日排便次数4～6次，红细胞沉降率为20～30 mm/h，血红蛋白为40～119 g/L，体温为36.1～37.8 ℃，脉搏60～90次/min；重度为每日排便次数>6次，红细胞沉降率>30 mm/h，血红蛋白<40 g/L，脉搏>90次/min，体温>37.8 ℃。

1.4 随访

采用复诊方式对UC患者进行为期3年的随访，记录患者的预后情况。本研究将复发、UC相关黏膜发育异常及发生UC相关结直肠癌定义为预后不良。随访起始时间为2013年5月18日，截止时间为2019年6月7日。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 两组SEMA3E miRNA的相对表达量比较

对照组SEMA3E miRNA的相对表达量为1.40±0.32，高于UC组(0.87±0.21)，差异有统计学意义(t=14.197，P<0.001)。

2.2 不同严重程度UC患者的SEMA3E miRNA相对表达量比较

缓解期患者SEMA3E miRNA的相对表达量为1.03±0.23，高于活动期患者(0.74±0.18)，差异有统计学意义(t=7.387，P<0.001)。61例活动期UC患者中，轻度组24例，中度组20例，重度组17例。轻度组、中度组、重度组SEMA3E miRNA相对表达量分别为0.86±0.20、0.75±0.18、0.56±0.14，3组患者血清SEMA3E miRNA相对表达量比较，差异有统计学意义(F=14.809，P<0.05)。重度组UC患者血清SEMA3E miRNA相对表达量低于中度组及轻度组(q=4.562，P<0.05；q=7.495，P<0.05)，中度组患者血清SEMA3E miRNA相对表达量低于轻度组(q=2.878，P<0.05)。

2.3 不同预后UC患者的SEMA3E miRNA相对表达量比较

109例UC患者随访期间的预后不良发生率为47.71%(52/109)，其中48例(44.04%)患者复发，3例(2.75%)发生UC相关黏膜发育异常，1例(0.92%)发生UC相关性结直肠癌。预后不良组SEMA3E miRNA相对表达量为0.62±0.15，低于预后良好组(1.09±0.24)，差异有统计学意义(t=12.123，P<0.001)。

2.4 不同预后UC患者的基本资料比较

预后良好组与预后不良组在年龄、BMI、吸烟、病变范围、家族史、低蛋白血症、IL-6、IL-15方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)。相较于预后良好组，预后不良组中女性占比较高，有结肠息肉、异型增生、基底浆细胞增多患者的占比较高，pANCA水平较高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 不同预后UC患者的基本资料比较

2.5 不同病变范围患者的SEMA3E miRNA相对表达量比较

直肠乙状结肠组(n=45)、左半结肠组(n=30)、广泛结肠组(n=18)、全结肠组(n=16)患者的SEMA3E miRNA相对表达量分别为0.82±0.18、0.88±0.20、0.86±0.21、0.91±0.25，4组间差异无统计学意义(F=0.982，P=0.403)。

2.6 影响UC患者预后的相关因素分析

根据pANCA、SEMA3E miRNA评估UC患者预后的最佳截断点将其转换为二分类变量。将性别(男=0，女=1)、结肠息肉(无=0，有=1)、异型增生(否=0，是=1)、基底浆细胞增多(否=0，是=1)、pANCA(<1.68=0，≥1.68=1)、SEMA3E miRNA(<0.83=0，≥0.83=1)作为自变量，将UC患者预后情况(预后良好=0，预后不良=1)作为因变量，纳入多因素Logistic回归分析，结果显示结肠息肉、异型增生、基底浆细胞增多、pANCA、SEMA3E miRNA与UC患者的预后密切相关。见表3。

表3 影响UC患者预后的相关因素分析

3 讨论

SEMA3E基因在胚胎发生及器官系统的轴突导向和形态发生中起重要作用[10]。SEMA3E基因对细胞的生长、存活、迁移及增殖均存在影响[11]。近年来有报道指出，SEMA3E基因可作为多种免疫细胞的新型调节因子[12]。SEMA3E基因表达降低可促进免疫细胞聚集，增强肠道炎性反应[13]。UC的发病与免疫失衡及肠道炎性反应密切相关，目前关于SEMA3E miRNA与UC患者疾病严重程度及预后关系的报道较少。

本研究中UC组的SEMA3E miRNA相对表达量低于对照组，提示SEMA3E miRNA可能与UC的发生有关；活动期UC患者的SEMA3E miRNA相对表达量低于缓解期患者，提示SEMA3E miRNA或可作为评估UC患者病情的潜在生物学标志物。本研究进一步比较了不同严重程度的活动期患者的SEMA3E miRNA相对表达量，结果发现重度组的SEMA3E miRNA相对表达量低于中度组及轻度组，中度组低于轻度组，提示SEMA3E miRNA的相对表达量可能与UC严重程度存在联系。此外，本研究结果显示，不同病变范围患者的SEMA3E miRNA相对表达量差异无统计学意义，提示病变范围对SEMA3E miRNA相对表达量无影响。随访结果显示，预后不良组的SEMA3E miRNA相对表达量低于预后良好组，表明SEMA3E miRNA可能与UC患者预后存在联系。本研究进一步采用Logistic回归方法分析影响UC患者预后的因素，结果发现结肠息肉、异型增生、基底浆细胞增多、pANCA与UC患者的预后密切相关，与以往的报道相符[14-15]。此外，本研究结果还指出SEMA3E miRNA与UC患者的预后密切相关。

p53可通过调节炎性反应诱导结肠细胞凋亡，其下游基因在UC的病理生理过程中发挥关键作用[16]。p53磷酸化后可促进结肠黏膜细胞凋亡，诱导UC发生，而阻断小鼠SEMA3E miRNA的表达后，可通过p53凋亡途径抑制炎性反应诱导的肠道上皮细胞凋亡，促进结肠黏膜愈合[17]。此外，SEMA3E miRNA具有调节IL-1β表达的作用，IL-1β主要由单核巨噬细胞产生，具有促进炎性细胞活化和聚集的作用。有研究指出，组织中生成大量的IL-1β后，可调节肠道T淋巴细胞和B淋巴细胞的活性，影响肠道免疫功能，导致肠道免疫性疾病发生[18]。由此推测，SEMA3E miRNA可能通过调节p53及IL-1β的表达，参与UC的疾病进展，但关于SEMA3E miRNA影响UC患者疾病严重程度及预后的病理生理机制尚不清楚。

综上所述，SEMA3E miRNA与UC患者疾病严重程度及预后的关系密切，检测SEMA3E miRNA相对表达量有助于评估患者的预后情况。本研究下一步将动态监测SEMA3E miRNA表达水平并进行动物实验，分析SEMA3E miRNA影响UC患者疾病严重程度及预后的病理生理机制。