CPNE家族在胃癌中的表达水平及其与患者预后的关系

张晓红 李 凡 贝颂华 李欢庆 李德明 冯 莉

胃癌是世界范围内病死率较高的恶性肿瘤，也是目前东亚地区较常见的胃肠道恶性肿瘤[1-4]。许多患者在初诊时即被诊断为进展期胃癌，错过了最佳手术期，而晚期胃癌患者的预后较差[5-6]。因此，亟需开展更多的研究来探寻应用于胃癌诊断和治疗的有效生物学标志物和靶标。大多数肿瘤患者的死亡与肿瘤转移及浸润有关。患者经胃切除术后，局部区域的肿瘤复发风险仍较高[7-8]。基于酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的特定分子靶向药物的应用可使转移性胃癌患者受益[9-10]。但由于肿瘤细胞的固有抗性或获得性抗性，胃癌患者仍会产生TKI抗性并导致不良的临床进展[11]。探索有效的预后分子生物学标志物及其在肿瘤进展、转移中的分子机制，对于评估和管理胃癌患者至关重要。

CPNE8是CPNE家族蛋白的成员之一，该家族蛋白是Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，被认为与跨膜运输有关[12-13]。已有报道指出，CPNE家族在肿瘤中发挥着重要的调控作用[14-16]。Jiang等[17]报道，沉默CPNE1可抑制人骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。Liu等[18]报道，CPNE1能够促进肺腺癌细胞的增殖和侵袭。CPNE3可通过激活黏着斑激酶(FAK)信号通路与活化的蛋白激酶受体1(RACK1)相互作用，促进非小细胞肺癌的迁移和侵袭[19]。CPNE5的表达水平可预测食管鳞状细胞癌根治性切除术后患者的预后情况[20]。PrP是主要位于细胞膜上的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，在其合成过程中，通过内质网和高尔基体转运至细胞膜，并与脂质筏相连。有研究认为PrP可通过网格蛋白介导的内吞作用不断地从细胞膜中回收[21]。家族性PrP的致病性突变通常会导致异常的细胞定位[22-23]。CPNE8在调控PrP的正常运输中发挥着至关重要的作用。PrP的异常往往与肿瘤的发生具有密切联系。目前CPNE8在胃癌中的作用尚不明确。本研究分析了肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库中具有临床病理学特征和患者生存率数据的CPNE的表达，使用基因集富集分析(GSEA)探究了CPNE可能参与胃癌进展的生物学机制。

1 材料和方法

1.1 公共数据分析

基因表达谱交互分析(GEPIA)数据库共有408例胃癌患者的基因表达数据以及36个正常胃组织样本的数据。基于该数据库中所有样本的临床信息，分析CPNE家族的表达水平与患者生存率的关系，以总生存时间为衡量指标。

1.2 RNA检测

使用TRIzol(美国Invitrogen公司)试剂提取组织RNA，严格按照试剂盒使用说明书操作。使用NanoDrop 2000分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司)检测RNA的纯度和摩尔浓度。按照制造商的说明进行定量聚合酶链反应(qPCR)分析。CPNE8的相对表达量以2-△△Ct表示 (ΔCt=CtCPNE8-CtGAPDH)，引物购自苏州金唯智生物科技有限公司，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 细胞培养和瞬时转染

AGS细胞和N87细胞均购自美国ATCC公司。在含有10% FBS(购自美国Gibco公司)和预防性支原体PlasmocinTM预防剂(ant-mpp)的高葡萄糖DMEM培养基(购自武汉普诺赛生命科技有限公司)中培养肿瘤细胞。在37 ℃下，5% CO2培养箱中培养。

1.4 细胞增殖试验

使用si-CPNE1或siRNA(购自上海吉玛制药技术有限公司)阴性对照(NC)转染A498和Caki-1细胞，然后将细胞以3 000个/孔的密度添加至96孔板中。使用细胞计数试剂盒8(日本同仁化学CCK-8试剂盒)检测细胞增殖率(OD值)。

1.5 生物信息学分析

使用DAVID生物信息数据库分析CPNE8参与胃癌发病机制的调控途径[20]。

1.6 统计学分析

所有数据均采用SPSS Statistics 22.0软件进行统计学分析。Kaplan-Meier(KM)曲线通过对数秩检验评估了患者的临床生存率和CPNE8的表达水平。采用单因素和多因素Cox比例风险回归方法分析胃癌中CPNE8的表达水平对于患者预后的意义[21]。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CPNE家族在胃癌中的表达

本研究分析了TCGA数据库中9个CPNE家族成员(CPNE 1～9)的信使RNA(mRNA)表达水平。由图1可知， CPNE1、CPNE2、CPNE3、CPNE7、CPNE8、CPNE9在胃癌组织中的表达水平显著高于正常胃组织，但CPNE6在胃癌组织中的表达水平显著低于正常胃组织。同时观察到，CPNE4和CPNE5在胃癌组织和正常胃组织中的表达水平差异无统计学意义。

2.2 CPNE家族的表达水平对于胃癌预后的意义

根据9个CPNE家庭成员的中位表达水平，将所有患者分为两组(高表达组和低表达组)。单因素分析显示，CPNE6和CPNE8的表达与患者的生存时间相关。KM曲线分析结果表明，CPNE8高表达患者的总生存时间比低表达者更短。此外，虽然CPNE6在胃癌中呈低表达，但是CPNE6高表达患者的总生存时间比低表达者更短。此外，研究显示CPNE1、CPNE2、CPNE3、CPNE4、CPNE5、CPNE7、CPNE9在胃癌中的表达水平与患者的总生存时间无显著关联。以上结果提示相较于其他家族成员，CPNE6和CPNE8在胃癌中发挥着更重要的作用。见图2。

图2 CPNE家族在胃癌组织中的表达水平与患者总生存时间的关联 A CPNE1 B CPNE2 C CPNE3 D CPNE4 E CPNE5 F CPNE6 G CPNE7 H CPNE8 I CPNE9

2.3 CPNE8与患者临床病理学特征的关联

由图3A可知，CPNE8高表达与肿瘤分期呈显著正相关。CPNE8在高分期胃癌中的表达水平显著高于低分期的胃癌样本。人种分析显示，CPNE8在非裔美国人中的表达水平显著高于白种人和亚洲人(见图3B)。CPNE8表达与淋巴结转移(N期)的关联分析显示，CPNE8在N1、N2、N3期胃癌中的表达水平显著高于N0期胃癌，其在N2期胃癌中的表达水平最高(见图3C)。CPNE8表达与年龄的关联分析显示，CPNE8在40岁以上胃癌患者肿瘤组织中的表达水平显著高于21～40岁者，其在41～60岁胃癌患者肿瘤组织中的表达水平最高(见图3D)。CPNE8表达与肿瘤分化程度的关联分析显示，CPNE8在低分化胃癌患者肿瘤组织中的表达水平显著高于中、高分化胃癌患者(见图3F)。而CPNE8的表达水平与患者的性别(见图3E)及幽门螺杆菌感染情况(见图3G)无相关性。

图3 CPNE8与胃癌患者临床病理学特征的关联 A 疾病分期 B 人种 C 淋巴结转移分期 D 年龄 E 性别 F 疾病等级 G 幽门螺旋杆菌感染状况

2.4 CPNE8在胃癌发病机制中的作用

本研究采用生物信息学手段探究CPNE8在胃癌发病机制中的作用。使用cBioPortal数据库获取CPNE8在胃癌中的共表达基因。结果表明，CPNE8可参与细胞黏附等细胞生物学过程，以及心血管系统发育、神经系统发育等过程(见图4A)。京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析显示，CPNE8在胃癌中参与调控的信号通路包括心肌细胞的肾上腺素信号转导、心律失常性右室心肌病(ARVC)、环鸟苷酸(cGMP)/蛋白激酶G(PKG)信号通路、扩张型心肌病(DCM)、细胞外基质(ECM)-受体相互作用、黏着斑、肥厚型心肌病(HCM)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路、Rap1信号通路、血管平滑肌收缩等(见图4B)。

图4 生物信息学预测CPNE8在胃癌中的功能与作用 A CPNE8在胃癌中参与调控的生物学进程 B CPNE8在胃癌中参与调控的信号通路

2.5 CPNE8表达下调抑制体外胃癌的恶性程度

使用siRNA敲低CPNE8在胃癌细胞(AGS和N87)中的表达水平，使用CCK-8探究敲低CPNE8表达对于胃癌细胞增殖的影响。结果显示，敲低CPNE8表达能够显著抑制胃癌细胞增殖(见图5)。

注：*P<0.05，**P<0.01图5 下调CPNE8对胃癌细胞增殖的影响 A 敲低CPNE8在AGS细胞中显著降低内源性CPNE8的表达 B 沉默CPNE8显著抑制AGS细胞的增殖 C 敲低CPNE8在N87细胞中显著降低内源性CPNE8的表达 D 沉默CPNE8显著抑制N87细胞的增殖

3 讨论

胃癌具有高病死率、高浸润率、高转移率的特点，其对于传统放射治疗、化学治疗的耐药性已成为了研究的重点[24-26]。本研究分析了9个CPNE家族成员在胃癌的临床样本中的表达情况，首次发现CPNE8高表达对胃癌患者的预后具有重要的意义，同时深入探究了CPNE8的生物学功能。

CPNE家族是一个普遍存在Ca2+依赖的磷脂结合蛋白家族，包含两个Ca2+和磷脂结合域，称为蛋白质中的“C2域”[27-28]。Copines具有磷脂结合特性，可参与跨膜运输，也可参与蛋白质-蛋白质相互作用，它们包含与整合素的蛋白质结合“A域”相似的域[29]。本研究首次全面而系统地揭露了CPNE家族在胃癌中的表达水平与患者预后的关联。结果显示，CPNE1、CPNE2、CPNE3、CPNE7、CPNE8、CPNE9在胃癌组织中的表达水平显著高于正常胃组织，但CPNE6在胃癌组织中的表达水平显著低于正常胃组织。通过分析CPNE家族与胃癌预后的关系，指出低表达的CPNE6和高表达的CPNE8与胃癌患者较短的总生存时间密切相关。以上结果提示CPNE家族可能可以作为新的胃癌诊断靶点。

本研究分析了TCGA数据库中，具有临床病理学特征和患者生存率数据的样本中CPNE8的表达情况，结果显示：(1)CPNE8在胃癌中明显高表达；(2)CPNE8高表达与TNM分期及肿瘤分化程度显著相关。此外，生物信息学分析结果显示，CPNE8高表达与细胞黏附、循环系统发育、cGMP/PKG信号通路、ECM-受体相互作用、PI3K/Akt信号通路、Rap1信号通路等有关。以上通路在胃癌中发挥着重要的调控作用，例如PI3K/Akt信号通路与胃癌细胞凋亡、血管生成及化学治疗耐药存在显著关联。

本研究结果表明，胃癌中CPNE8表达明显上调并与多种临床病理学特征相关。 CPNE8高表达与疾病进展呈显著正相关，提示CPNE8可作为胃癌患者预后的独立预测因子，并参与了胃癌的发展。在胃癌细胞中，敲低CPNE8表达能够显著抑制肿瘤细胞增殖。本研究为了解CPNE8在胃癌中的潜在作用提供了线索，并指出CPNE8表达下调可能为胃癌患者的治疗和操作提供新的治疗策略。