miR-211-5p和p27Kip1在原发性胃癌组织中的表达水平与临床病理学特征的相关性研究

张永健 郭学海 高秀凤 赵振伟

胃癌是病死率较高的胃肠道恶性肿瘤，据统计，全世界每年新诊断为胃癌的患者约有1 000 000例，胃癌的高发地区是东亚和东欧，男性发病率高于女性[1]。近年来，采用手术和化学治疗方法治疗胃癌取得了一定的进展，但胃癌患者的预后仍然较差，患者的生存率较低[2-3]。因此，临床上探索新的有效指标来判断胃癌的预后情况具有重要价值。

近年来，胃癌发病分子机制研究的热点聚焦于抑癌基因或促癌基因变异所致的功能因子表达异常。微RNA(miRNA)是一种小的非编码RNA分子，与靶信使RNA(mRNA)的3′非翻译区(UTR)结合，导致翻译抑制或mRNA降解，能够在转录水平上调控基因表达，从而抑制或促进肿瘤形成，与肿瘤的进展密切相关[4]。有研究表明，miR-211-5p在人类不同类型的肿瘤中异常表达，如miR-211-5p在非小细胞肺癌[5]和黑色瘤[6]中的表达显著上调，且miR-211-5p的高表达与患者预后不良有关；另有研究显示，miR-211-5p在乳腺癌[7]和骨肉瘤[8]中表达下调，可发挥抑癌作用。目前miR-211-5p在胃癌组织中的表达及其与患者临床病理学特征相关性的报道较少。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p27Kip1作为细胞周期G1/S转换的负性调控因子在肿瘤的发生、发展中起重要作用[9]。研究发现，p27Kip1在乳腺癌[10]和胃癌[11]等肿瘤中表达显著下调，并与这些肿瘤的发生和侵袭转移密切相关。

本研究通过检测miR-211-5p和 p27Kip1在胃癌患者的肿瘤组织和癌旁组织中的表达水平，分析miR-211-5p与 p27Kip1表达的相关性，以及miR-211-5p和 p27Kip1的阳性表达与胃癌患者的临床病理学特征和预后的相关性，以期为胃癌的诊断和预后判断提供一定的临床参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2015年8月至2016年8月在开滦总医院林西医院接受手术的60例患者的原发性胃癌及癌旁组织(距离肿瘤组织边缘>2 cm)标本，所有患者均经病理检查证实为原发性肿瘤患者。其中男性38例，女性22例；年龄23～82岁，平均年龄为53.6±11.7岁，其中年龄<60岁有22例，≥60岁有38例；肿瘤位于胃窦部22例，贲门部11例，胃体部27例；低、中分化42例，高分化18例；按照国际抗癌联盟(UICC)制订的TNM分期图谱，本研究患者中Ⅰ期8例，Ⅱ期13例，Ⅲ期29例，Ⅳ期10例。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，并经医院伦理委员会核准，所有患者及家属对本研究充分知情并签署知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 实时定量聚合酶链反应 应用组织裂解液对收集的胃癌组织标本和配对的癌旁组织标本进行裂解，提取总RNA。应用反转录试剂盒(购自日本Takara公司)将RNA反转录为cDNA，以实时定量聚合酶链反应法测定miR-211-5p和p27Kip1的表达水平。

1.2.2 免疫组织化学法 将收集的胃癌组织和配对的癌旁组织标本应用4%的甲醇溶液固定，石蜡包埋，切片(厚度为4 μm)。随后按照Histostain○R-Plus试剂盒(购自北京中杉金桥生物有限公司)说明书进行切片的免疫组织化学染色。在光学显微镜下观察，随机抽取5个4×100视野，应用Version 4.1图像分析系统分析并记录。染色强度：黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；根据细胞染色面积(阳性细胞百分率)评分：0～5%计0分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分。以两项评分之积作为阳性表达的判定标准：0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8 分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

1.3 随访

依据纳入研究的时间，对研究对象进行36个月的随访，记录患者的生存时间。随访终点为：(1)患者死亡；(2)患者退出该项研究；(3)36个月随访结束。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 miR-211-5p和p27Kip1在胃癌组织和癌旁组织中的表达水平比较

如表1所示，miR-211-5p在胃癌组织中的阳性率(81.67%)显著高于癌旁组织(6.67%)，p27Kip1在胃癌组织中的阳性率(43.33%)显著低于癌旁组织(88.33%)，差异均有统计学意义(P均<0.001)。

表1 miR-211-5p和p27Kip1在胃癌组织和癌旁组织中的表达水平比较/例(%)

2.2 miR-211-5p表达水平与胃癌患者临床病理学特征的关系

由表2可知，miR-211-5p在TNM分期为Ⅲ、Ⅳ期，有淋巴结转移，深肌层浸润的患者中的阳性率较高，且差异具有统计学意义(P<0.05)；而在性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小和组织分化程度不同的胃癌患者中，miR-211-5p阳性率的差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 miR-211-5p表达水平与胃癌患者临床病理学特征的关系/例(%)

2.3 p27Kip1表达水平与胃癌患者临床病理学特征的关系

由表3可知，p27Kip1在TNM分期为Ⅲ、Ⅳ期，有淋巴结转移，高分化及深肌层浸润的患者中的阳性率较低，且差异有统计学意义(P<0.05)；而在性别、年龄、肿瘤位置和肿瘤大小不同的胃癌患者中，p27Kip1阳性率的差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 p27Kip1表达水平与胃癌患者临床病理学特征的关系/例(%)

2.4 miR-211-5p和p27Kip1在胃癌组织中表达的相关性分析

采用Kendall′stau-b等级相关分析法检测胃癌患者的miR-211-5p和p27Kip1表达的相关性，发现miR-211-5p和p27Kip1在胃癌组织中的表达呈显著负相关(r=-0.455，P<0.031)，如表4所示。

表4 miR-211-5p和p27Kip1在胃癌组织中表达的相关性分析/例(%)

2.5 miR-211-5p和p27Kip1表达水平与患者生存率的关系

采用Kaplan-Meier生存曲线统计患者的3年生存率，结果发现miR-211-5p阳性表达者的3年生存率显著低于阴性表达者(log-rankχ2=19.85，P<0.000 1)；而p27Kip1阳性表达者的3年生存率则显著高于阴性表达者(log-rankχ2=17.53，P<0.000 1)。见图1、图2。

图1 miR-211-5p和p27Kip1表达水平与患者生存率的关系 A miR-211-5p B p27Kip1

3 讨论

目前在中国，胃癌的发病率位居消化道恶性肿瘤之首，由于早期筛查尚未在中国普及，大部分胃癌患者在就诊时已处于中晚期[2]。胃癌的早期症状不明显，治疗方法单一，预后评估不良，目前对于晚期胃癌尚无有效的治疗方法。胃癌的恶性程度较高，部分患者可复发，导致患者的5年生存率较低[1,3]。因此，探索新的有效指标进行早期胃癌筛查并判断预后情况，对提高胃癌患者的生存率具有重要价值。基因和表观基因的改变与肿瘤的发病有关，其分子学机制包括抑癌基因失活、致癌基因激活等，可使细胞增殖失控，肿瘤细胞侵袭转移，进而导致恶性转化[12]。丰富的miRNA在胃癌发生中可调节广泛的生物学过程[4]。本研究结果显示，miR-211-5p在胃癌组织中表达升高，且与患者的TNM分期、淋巴结转移和浸润深度呈正相关，即在TNM分期为Ⅲ、Ⅳ期，有淋巴结转移和深肌层浸润的患者中，miR-211-5p阳性率较高。生存曲线分析显示，miR-211-5p阳性表达者的3年生存率显著低于阴性表达者，提示miR-211-5p的异常表达与胃癌患者的预后不良有关。以上结果表明，miR-211-5p在胃癌患者中作为促癌因子发挥作用，这与以往关于miR-211-5p在其他肿瘤中的报道相符[13]。miR-211-5p的作用复杂且具有争议性，在不同类型的肿瘤组织中，miR-211-5p可发挥不同的生物学效应，既可作为促癌因子促进肿瘤发生、发展，也可作为抑癌因子抑制肿瘤的进展。本研究中，miR-211-5p作为促癌因子发挥其生物学效应，促进胃癌的发生、发展。

肿瘤的恶性增生是由于肿瘤细胞增殖和细胞分裂失控所导致的，而细胞周期调节失控是肿瘤发生、发展的重要环节。p27Kip1作为细胞周期抑制蛋白成员之一，可以负性调节细胞周期，是一种抑癌基因[14]。p27Kip1的活性改变可影响细胞周期进程，进而影响细胞增殖，与肿瘤的发生、发展密切相关[15]。在多种肿瘤中，p27Kip1蛋白的表达均与肿瘤的恶性程度、浸润能力及预后呈负相关。Bochis等[16]的研究显示，p27Kip1蛋白在结直肠癌组织中表达下调，与TNM分期及病理分化程度密切相关；Yang等[17]发现，RanBP2介导了p27Kip1的泛素化降解，促进了胆管癌细胞增殖；Shapira等[18]发现，p27Kip1在前列腺癌中表达显著下调；Liu等[19]发现，p27Kip1表达下调与肾细胞癌患者预后不良相关。本研究结果指出，p27Kip1在胃癌组织中表达下调，且在TNM分期为Ⅲ、Ⅳ期，有淋巴结转移，高分化及深肌层浸润的患者中的阳性率较低；而性别、年龄、肿瘤位置和肿瘤大小不同的胃癌患者中p27Kip1表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。生存曲线分析显示，p27Kip1阳性表达者的3年生存率显著高于阴性表达者，提示p27Kip1作为抑癌因子，在胃癌的发生、发展中发挥生物学效应。此外，本研究发现miR-211-5p与p27Kip1的表达呈显著负相关，进一步证明miR-211-5p和p27Kip1在胃癌中分别作为促癌因子和抑癌因子发挥作用。

综上所述，检测miR-211-5p和p27Kip1在胃癌中的表达水平，有利于评估肿瘤的发生、发展及转移情况，从而指导胃癌患者的临床诊治。