153例多发性骨髓瘤的细胞遗传学分析

徐凯红， 牧启田， 欧阳桂芳， 严 笑

（宁波市第一医院血液科，浙江 宁波 315000）

多发性骨髓瘤（multiple myeloma ，MM）是一种不可治愈的血液系统常见肿瘤，临床表现为不同程度的贫血、肾功能不全以及骨痛，总生存时间（overall survival，OS）一般为2～10年[1]。有研究结果表明，基因组在MM的发生和发展中起着至关重要的作用[2]。细胞遗传学异常，如t（4；14）、del（17/17p）、t（14；16）、t（14；20）、非超二倍体等与MM预后不良相关，而t（11；14）通常预后较好[3]。因此，细胞遗传学异常已成为MM危险分层中最重要的部分，对预后和治疗方案的选择有重要指导作用。

近年来的新兴检测技术，特别是二代测序（next-generation sequencing，NGS）技术的出现，使细胞遗传学分析具有更高的灵敏度和通量[4]。常规核型分析在MM细胞遗传学和危险分层中的作用似乎正在减弱[5]。本研究回顾性分析了153例MM患者的细胞遗传学异常情况，评价细胞遗传学分析在MM中的应用价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2015年10月—2018年10月经国际骨髓瘤工作组标准被确诊为MM的153例患者作为研究对象，其中男91例，女62例，年龄47～84岁，包括IgG型87例（56.9%）、IgA型32例（20.9%）、轻链型27例（17.6%）、不分泌型4例，IgD型3例，国际分期系统（international staging system，ISS）分期Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分别为36例、65例和52例。对所有对象的骨髓标本进行常规R显带和间期荧光原位杂交（interphase fluorescencein situhybridization，iFISH）分析。所有患者选用以velcade为基础的诱导治疗，48例（31.4%）随后进行自体造血干细胞移植，其他105例患者由于无法耐受，接受非强化治疗。本研究经宁波市第一医院伦理委员会批准并取得患者知情同意。

1.2 染色体核型分析

骨髓细胞染色体核型分析采用常规R显带。加入秋水仙碱使其终浓度为0.1 ng/L，孵育50 min。用氯化钾溶液进行低渗处理并用甲醇冰醋酸混合液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定，细胞悬液制片后热处理变性，最后染色观察。至少观察20个有丝分裂，核型描述按照《国际人类细胞遗传学命名系统》[6]进行。将染色体数目≥47且＜75定义为超二倍体，将亚二倍体、假二倍体和近四倍体定义为非超二倍体[7]。

1.3 iFISH分析

对CD138纯化的骨髓细胞进行iFISH分析。选择5个特异的DNA探针：针对17p13.1的LSI-TP53探针（美国雅培分子公司）、针对13q14不同位点缺失的LSI-RB1和LSI-D13S319探针（美国雅培分子公司）、针对14q32的LSI-IGH双色分离重排探针（美国雅培分子公司）、针对1q21扩增的1q21探针（广州LBP医药科技有限公司）。探针和标本DNA在73 ℃下变性5 min，用10 μL 6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，4'，DAPI）（德国罗氏公司）进行细胞核复染。每个探针至少分析200个间期细胞。所有iFISH探针均采用阴性和阳性对照进行验证，当阳性信号百分比超过阈值时，则判定为阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。采用χ2检验或Fisher精确检验进行比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 染色体核型分析结果

对153例MM进行染色体核型分析，染色体异常的检出率为28.1%（43/153）。69.8%的患者（30/43）同时存在数量和结构上的异常（图1）。单纯的染色体数目异常多见于超二倍体，而单纯结构异常则仅见于非超二倍体（表1）。

图1 异常染色体核型

表1 MM常规核型分析结果 例

细胞遗传学异常主要集中在13号染色体（20/43，46.5%），其次是9、14、1号染色体（19/43，44.2%）和8号染色体（18/43，41.9%）上。染色体数目增加最常见于9号染色体（17例，39.5%），其次是5号和15号染色体（各10例，23.3%）；染色体缺失最常见于8号染色体（9例，20.9%），其次是13号染色体（7例，16.3%）和14号染色体（6例，14.0%）；染色体结构异常最常见于1号染色体（15例，4.9%），其次是14号染色体（10例，23.3%）和13号染色体（9例，20.9%）。见图2。

图2 43例MM核型异常在具体染色体中的分布

2.2 iFISH检测分析

采用5种常规探针，iFISH共检出109例（71.2%）异常，其中最常见的异常是IGH重排，占55.6%（85例）；其次是1q21扩增（82例，53.6%）、RB1缺失（64例，41.8%）、D13S319缺失（60例，39.2%）、TP53缺失（21例，13.7%）。其中，探针LSI-RB1和LSID13S319与13914杂交，2个位点缺失频率无显著差异（P＞0.05）。iFISH检出只有1种异常的患者仅23例（21.1%），其他108例患者均同时出现2～5种异常。见图3和图4。

图3 iFISH检出的5种细胞遗传学异常

图4 iFISH检出的5种细胞遗传学异常的分布

在153例MM患者中，R显带和iFISH联合应用可使细胞遗传学异常的检出率提高到79.1%（121/153）。121例检出细胞遗传学异常的患者中，9例MM患者R显带检出核型异常，但iFISH阴性（表2），占所有细胞遗传学异常患者的7.4%（9/121）。对9例患者随访至2020年1月10日，中位随访时间为3.1年（随访1.3～4.2年），其中有2例仍处于平台期，其他7例无疾病进展时间（progression-free survival，PFS）均＜3年，其中包括2例死于感染和心力衰竭的患者。

表2 9例iFISH检测阴性的MM患者核型

3 讨论

MM是一种基因复杂的肿瘤性疾病。细胞遗传学技术的最新进展表明，几乎所有的MM患者都存在细胞遗传学的异常[8]。新的分子细胞遗传学技术，尤其是NGS技术，虽然可以提供更多关于细胞遗传学的信息，但由于成本高、缺乏统一规范等，导致应用受到限制。iFISH是目前临床上应用最广泛的细胞遗传学检测方法，是危险分层和预后的主要基础[9]。

在本研究中，iFISH异常的检出率与文献[10-11]相似，本研究使用探针LSI-RB1（13q14.1-14.2）和LSI-D13S319（13q14.3）与13q14杂交，2个位点缺失频率无显著性差异（P＞0.05）。而且，本研究共有30例（34.9%）RB1和D13s319同时缺失，统计学分析证实这2个位点高度相关（r=0.966）。这一结果说明，MM 13号染色体的异常多表现为13q的大片段缺失或整条13号染色体的缺失 。临床上可只选取LSI-RB1或LSI-D13S319探针中的1种来检测13q14的缺失。

在本研究中，MM染色体核型分析的检出率与文献报道相似[12-13]，且细胞遗传学异常主要集中在13号染色体，其次是9、14、1号染色体和8号染色体上。有研究证实13号染色体缺失、14号染色体IGH重排、1q21扩增和8号染色体畸变在MM发病机制中具有重要价值[14]，与本研究发现的遗传学异常好发染色体一致。本研究还发现9号染色体的异常，且+9出现频率较高。有研究者推测，位于9p21上的p16和p15抑癌基因拷贝数的增加，可能会使MM有良好的预后[15]，但对9号染色体的研究尚未见深入报道。由于超过1/3的MM患者存在9号染色体异常，且其生物学机制尚不清楚，值得进一步研究。

iFISH结合染色体核型分析，细胞遗传学异常检出率可达79.1%。尽管iFISH在揭示遗传学异常方面有很高的效率，但本研究中核型分析异常的患者中仍有7.4%（9/121）的患者iFISH检测阴性。iFISH的效率很大程度上取决于探针的组成。虽然，使用足够多的探针几乎可以识别所有的细胞遗传学异常，但是成本会大大增加。在临床实践中，iFISH探针只针对发病率较高或有预后意义的重复性异常，因此检出效率受到影响。由于随访时间的限制，无法统计出所有的OS，我们统计了这9例患者的PFS，发现其中7例患者PFS＜3年；第1例和第2例伴有+3和/或+5的超二倍体，根据常规判断，本该有良好的预后[15]，短期出现了疾病进展可能是由于出现+21和≥2个额外的结构染色体异常，文献报道可导致较差的临床预后[16-17]。第3例和第4例患者也均为超二倍体，但同时伴有8号染色体异常。研究证实，8p21的缺失可导致MM患者对硼替佐米耐药，还可能导致相关基因（TRAIL-R4、CCDC25、RHOBTB2、PTK2B、SCARA3、MYC、BCL-2和TP53等）表达谱的改变，这些基因的表达与MM的发生、发展有重要关系[18]。染色体8q24.1/c-myc异常也被认为是高危骨髓瘤的一个标志[19]。本研究也证实8号染色体是细胞遗传学异常最集中的染色体之一，这些研究结果一定程度上解释了本研究第3例和第4例患者预后欠佳的原因，其他5例均存在意义未明的结构异常，由于没有商品化的iFISH探针，因此无法进行检测。我们还发现大多数（78.9%）iFISH阳性患者具有2种及以上异常，染色体核型分析也显示，69.8%的MM同时存在染色体数量和结构异常，这提示MM的预后是多基因共同作用的复杂细胞遗传学结果。当细胞遗传学上预后良好和预后不良的特异性改变同时出现时，具体临床表现以哪一方占主导地位，尚需进一步探讨。

综上所述，尽管核型分析在MM的细胞遗传学分析中效率不高，但其能够提供MM完整的细胞遗传学信息，揭示商品化iFISH探针无法检出的位点。大规模的染色体核型分析，有助于确定染色体上特定的位点，为进一步的MM分子发病机制和化疗靶向位点的研究提供参考。