细胞外囊泡检测技术及其临床应用进展

刘春辰， 林慧娴， 郑 磊

（南方医科大学南方医院检验科，广东 广州 510515）

细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）是细胞分泌至胞外的一种含脂质双分子层的膜性囊泡，依据其形成机制与直径差异，可分为外泌体、微囊泡与凋亡小体三大亚群，EV内含特异性蛋白质、活性核酸和脂质，有望成为揭示疾病发生机制和应用于临床诊疗领域的一种新型标志物[1]。在机体中，EV以非均一膜性囊泡的结构广泛散在于各类体液中，包括血浆、血清、唾液、乳汁和尿液等[2]。作为“液体活检”的后起之秀，EV丰度远高于循环肿瘤细胞，且受膜形式的保护，其内容物稳定性较好，克服了体液样本中ctDNA易降解等弊端[3]。相对于组织病理检查，基于血液等样本的EV检测具有无创、取样简便等优势，患者依从性更高，便于病情监测，易于及时调整治疗方案；与传统血清游离核酸与蛋白标志物检测相比，EV检测具有靶向性显著、信息量更丰富、检测基质干扰小等优势[4-5]。因此，EV对疾病的早期诊断和疗效监测有重要的临床价值。本文对目前常用的EV分离富集和鉴定技术，以及EV不同内容物的检测技术的优缺点和临床应用进行综述。

1 EV分离富集技术与检测

基于EV大小、密度等物理性质及其特有的蛋白质生物学特性，去除体液样本中杂质蛋白、脂质等复杂成分的干扰，实现EV的分离富集，是其内容物准确分析的前提。EV分离富集的回收率、纯度及其活性直接影响着EV后续鉴定与内容物检测。目前EV常用的分离富集技术及其优缺点见表1。超速离心法是目前被广泛认可的EV分离富集的金标准。TIAN等[6]对包括超速离心法在内的尺寸排阻色谱法等6种EV分离富集技术进行了EV纯度与分离效率的综合评估，证实超速离心法分离所得的EV纯度最高，可有效用于后续内容物的检测和分析。

2 EV鉴定分析技术与检测

鉴于体液样本成分的复杂性，体液样本中存在许多干扰EV检测的物质，包括某些蛋白质和颗粒性组分，且部分杂质在大小与密度上与EV存在重叠，如脂蛋白等，可能会与EV共分离。为保证EV的准确检测，同时也为了保证不同研究结果的可信度与可重复性，有必要对分离出的EV进行鉴定。依照国际细胞外囊泡协会（the International Society for Extracellular Vesicles，ISEV）发布的EV研究最低要求国际研究指南的要求，应对EV进行形态学特征、浓度、粒径等非特异性鉴定和特定蛋白质分子的特异性鉴定，可累加EV内组分的拓扑鉴定[7]，为后续EV的准确检测提供必要保障。具体鉴定技术见表1。

表1 EV常用的分离富集与鉴定技术及其优缺点

3 EV内容物检测技术

EV可选择性包裹活性核酸、蛋白质和脂质，运载众多信号分子，经胞膜直接融合、配体-受体特异性结合以及胞吞等方式与靶细胞结合，通过释放其内容物发挥特定的生物学作用。因此，EV内容物的检测和分析是剖析EV功能的关键环节，对揭示EV在疾病中的具体作用机制及EV的临床应用具有重要意义。目前，基于EV的临床诊断技术的开发也大多聚焦于不同亚群特异性内容物的检测，主要包括核酸、蛋白质，以及以脂质为代表的代谢分子三大领域。

3.1 核酸检测

EV的核酸内容物包括RNA[mRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）和其他非编码RNA等]及DNA[21]，目前以RNA类的研究居多，主要反映EV实行具体功能的转录及其调控层面的信息。

针对RNA类内容物，传统的检测技术包括琼脂糖凝胶电泳、免疫印迹法、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）（荧光定量PCR[22]、液滴式数字PCR[23]）以及芯片技术、二代测序技术[22]等。其中芯片技术与测序技术适用于对样本的RNA进行高通量检测，主要用于疾病特异性标志物的筛选。PCR的灵敏度高，但易发生偏性扩增，应避免因污染而产生的假阳性现象；同时，受引物合成技术的限制，PCR只能对已知序列的特定RNA进行分析。

近年来，一系列针对EV的RNA内容物的新型检测平台被开发出来，检测原理呈多样化趋势，其中以荧光探针类研究居多，融合了纳米技术、微流控技术，以及仿生学等不同学科的技术优势。基于多色荧光PCR的EV-lncRNA分析芯片[24]和功能化金纳米荧光探针[25]均可通过荧光直接实现对靶RNA的高效检测；其中功能化金纳米荧光探针可实现外泌体miRNA-1246的原位检测，可区分乳腺癌人群与健康人群。部分平台则先通过疾病相关的特异性蛋白分子对靶外泌体实现捕获，再检测其RNA内容物，进一步提高特异性。YANG等[26]设计的免疫生物芯片通过静电作用将含分子信标的阳离子脂质体与捕获的外泌体融合，随着分子信标的注入实现miRNA-21和TTF-1 mRNA的高效检测，可用于肺癌诊断。近期有研究报道的汇集了仿生学优势的微流控芯片——NanoVilli芯片，可有效提升肺癌EV中RNA的检测灵敏度和特异性[27]。以上EV核酸检测技术的总结与应用见表2。

3.2 蛋白质检测

EV富含蛋白质类标志物，如热休克蛋白、膜联蛋白、整合蛋白、黏附分子、信号转导因子等[21]。蛋白质作为生物学功能的主要执行者，其携带的翻译后分子水平信息，相对于核酸携带的转录水平信息，更契合EV的功能状态，并可更直接地反映这一状态。

传统的检测方法，如免疫印迹法[28]、ELISA[29]、流式细胞术[30]及质谱[31]等可对EV中的蛋白质类内容物进行定性和/或定量检测。免疫印迹法和ELISA基于抗原-抗体特异性结合的原理，特异性好，但其受抗体制备技术的限制，且针对的仅是样本总蛋白层面的特定蛋白分子；传统的流式细胞术无法对小于200 nm的粒子进行分析，限制了流式分析的在EV检测中的应用。近年来，传统流式细胞术的改进[32]和高敏流式细胞术[33]的出现，大大提高了仪器的检测性能，使单个EV水平的多参数分析成为可能。质谱[20]作为一种高通量技术，可同时检测EV的多种蛋白质标志物，具有灵敏度高、分析速度快等优势。

蛋白质标志物作为剖析EV功能的重要组分，对其检测的灵敏度、特异性及临床有效性要求日益提升。近年来，不同原理的新技术平台逐渐被应用于EV的蛋白质检测中，并逐步用于临床疾病的诊疗、病情监测及预后评估等。陈贤华等[34]构建的外泌体双膜蛋白共表达检测平台，先用修饰有CD63抗体的磁珠实现外泌体的捕获，再联合适配体特异性结合与发夹催化自组装信号放大技术（catalytic hairpin assembly，CHA）实现外泌体膜上的CD63和上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）2种蛋白质标志物的同时检测，可用于区分乳腺癌来源和正常乳腺上皮来源的外泌体。LIU等[35]报道了一种新技术——液滴数字外泌体酶联免疫吸附试验（exosome-counting enzyme-linked immunosobent assay，ExoELISA），该技术通过抗原-抗体特异性结合原理捕获表达磷脂酰基醇蛋白聚糖-1（glypican-1，GPC-1）的外泌体，并形成酶促分子标记的ELISA夹心复合物，固定于磁性微珠上，最后将其包裹进液滴中，实现了对靶外泌体的绝对定量。此外，集适体结合与滚环扩增技术于一体的荧光生物传感平台[36]、融合了声学传感优势的纳米金标记放大表面声波（surface acoustic wave，SAW）传感器[37]，以及电化学领域的Aptasensor[38]、微流控领域的Exodisc-B/P[39]等技术，在检测EV的灵敏度与特异性方面均有明显提升，部分检测平台已可用于疾病的诊断、预后评估等。以上新技术的总结见表2。

3.3 脂质检测

除活性核酸与蛋白质外，EV中还含有以脂质为代表的一系列代谢分子，包括胆固醇、神经酰胺、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）等[21]。目前，针对脂质的检测方法相对较少，主要为脂质组学和代谢组学方法，如全反射傅里叶变换红外光谱[40]、荧光测定法（使用DiR等亲脂性荧光染料）[41]、薄层色谱法、高效液相色谱法及高通量质谱[42]等。SMITH等[43]利用拉曼光谱以及主成分分析技术发现癌性与非癌性细胞系衍生的外泌体在胆固醇与磷脂的相对表达上存在差异，提示外泌体中的脂质有成为肿瘤标志物的潜力[43]。还有研究者通过高通量质谱技术对前列腺癌患者及健康人尿液样本中的外泌体脂质进行检测，发现PS（18：1/18：1）与乳糖神经酰胺（lactosylceramide，LacCer）（d18：1/16：0）等9种脂质水平存在差异，其中LacCer（d18：1/16：0） /PS（18：1/18：1）比值与PS（18：0-18：2）/PS（18：1/18：1）比值联合检测区分前列腺癌患者与健康人的敏感性为93%、特异性为100%[42]。相关检测技术及其应用见表2。

表2 EV内容物检测新技术

4 总结和展望

EV作为一种蕴含丰富生物信息的循环标志物，广泛散布于各类体液中，且受脂质双分子膜的保护，内容物稳定，因此在丰度以及稳定性上具有明显优势，在疾病的早期诊断、病情动态监测及预后评估等方面均具有巨大的应用前景。近年来，各类新型检测平台的不断被开发出来，在灵敏度、特异性及检测时间上的性能均明显提升，对EV内容物（核酸、蛋白质与脂质等）有了更深入的研究，并开始关注单个EV水平的检测，突出其异质性，这有利于对EV进行更深入、更精准的功能分析，进一步推动EV的临床应用进程。然而，目前仍存在许多复杂因素，使EV检测应用于临床疾病的精准诊疗面临诸多挑战，如EV在样本采集及保存过程中是否存在影响其检测结果的因素尚不得而知，检测的灵敏度、特异性、经济成本等方面如何平衡亦值得思考。此外，EV检测技术尚缺乏统一的标准操作指南，临床统一的参考区间仍处于空白，质量控制体系亦不完善，各平台的检测结果难以进行横向比对，结果溯源链缺乏，这些问题均限制了EV的临床应用。未来，研究者们应致力于充分发挥声学、光学、电磁学、机械自动化以及纳米技术等多学科优势，促进EV检测平台向微型化、自动化和便捷化发展，同时完善EV的质量控制体系，加快相应参考区间的建立，以加速推进EV检测的临床应用进程。