香水莲花花色素苷的提取及稳定性

周 琦，赵 峰，张慧会，祝遵凌，汤 鹏

（1.江苏开放大学 a.环境生态学院；b.建筑工程学院，江苏 南京 210036； 2.南京林业大学 a.风景园林学院；b.艺术设计学院，江苏 南京 210037）

香水莲花Nymphaea hybrida是睡莲科睡莲属珍贵的水生观赏花卉，属于热带大型睡莲，其花形优美，花色鲜艳，花香怡人，观赏价值极高[1-2]。在中国，香水莲花主要分布在海南、福建、广州、浙江、江苏等地区，在园林中除可用于盆栽、水景布置及鲜切花等，还可用于压制干燥花[3]。由于体内富含丰富的营养物质和生物活性物质，其在食品和医药方面也具有十分广阔的应用前景[4-5]。

花色素苷类色素是自然界中最广泛存在的一种天然色素，可以从水果[6]、蔬菜[7]和某些花的花瓣[8-9]中提取出来，影响植物的呈色。以往对花色素的研究大多集中在月季[10]、芍药[11]、菊花[12]、海棠[13]等观赏植物，对水生植物的研究报道较为鲜见。花色素苷类色素被认为是一种潜在的人工合成色素替代品，其色彩鲜亮，具有水溶性，能提高视力，具有抗衰老、抗癌和抗病毒等生物活性[14]。然而，花色素苷颜色的稳定性受外界环境影响较大，在生产处理和储存过程中极易变色，这种不稳定的化学性质和极高的降解速度制约了花色素苷类色素在商业中的应用。提高花色素的稳定性对于改善干燥花保色技术十分重要。

香水莲花鲜花花瓣中含有大量的花色素苷类色素，色彩鲜艳，具有良好的开发前景，而关于香水莲花花色素提取及稳定性的研究鲜见报道。本文中以紫色香水莲花和粉色香水莲花为研究对象，筛选香水莲花花色素的适宜提取条件，并对其色素的稳定性进行初步研究，旨在为香水莲花花色素的开发利用以及干燥花保色研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验材料采自厦门香水莲花种质资源圃，包括香水莲花紫色品系中的“紫花型”香水莲花（紫色）和粉色品系中的“粉花型”香水莲花（粉色），分别简称为“紫色香水莲花”和“粉色香水莲花”。于晴天8:00，温度约26 ℃，露水刚干时，采集盛花期的香水莲花花朵由外至内第3 轮花瓣。每个品系取3 次重复，每个重复选取5 朵花，要求5朵花分别生长于5 株对应花色的香水莲花植株上。釆后，将花瓣立即用锡箔纸包好，液氮保存，然后置于实验室-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2 方 法

1.2.1 香水莲花花色素苷提取条件的确定

1）提取溶剂的选择。称取1 g 香水莲花花瓣，分别加入3 种浸提溶剂各10 mL（1%盐酸甲醇、1%盐酸乙醇、0.1 mol/L 盐酸），置于32 ℃的恒温水浴锅中避光浸提6 h，过滤后定容至25 mL 的容量瓶中，以提取剂为对照，用紫外可见分光光度计扫描，波长为400 ～700 nm，每处理设3 次重复，并进行比较分析，确定合适的提取溶剂。

2）提取时长的确定。称取1 g 香水莲花花瓣，加入10 mL 上述试验中确定的提取溶剂，置于32 ℃ 的恒温水浴锅中分别避光浸提1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 h，过滤后定容至25 mL 的容量瓶中，以1%的盐酸甲醇溶液为对照，用紫外可见分光光度计检测提取液在530 nm 处的吸光值（A530），每处理设3 次重复，参考徐丽萍等[15]的方法，以每克鲜样在10 mL 提取液中的吸光值0.1 为1 个色素单位，计算花色素苷含量（C），并加以比较分析，确定合适的提取时长。

1.2.2 香水莲花花色素苷稳定性的测定

称取5.00 g 香水莲花花瓣，加入50 mL 1%的盐酸甲醇提取剂充分研磨后，移到试剂瓶中，在32 ℃的恒温水浴锅中避光浸提，浸提时长根据1.2.1 中试验结果进行确定。过滤去渣，置于-4 ℃的冰箱中黑暗保存备用。取1 mL 提取液置具塞试管中，加入9 mL 含1%浓盐酸的甲醇，分别检测光照、温度对色素颜色的效应[16]。测定无其他条件影响下提取液在对应检测波长下的初始吸光值（ACK）。

1）光强对花色素苷颜色呈现的效应。光强设置自然光照、日光灯照和避光3 种处理。自然光照处理为将花瓣色素提取液置于室内向阳窗台上；日光灯照处理为将提取液置于恒温光照培养箱中，光强设置为(6 300±100) lx，温度设置 为(20.0±0.5) ℃；避光处理为将提取液置于避光条件下的恒温培养箱中，温度设置为(20.0±0.5) ℃。每天白天将装有色素提取液的具塞试管放在3 种光照条件下，静置10 h，然后取样测定波长530 nm 处的吸光值（A530），晚上再置于避光培养箱中，连续测定8 d。

2）温度对花色素苷颜色呈现的效应。在室内日光灯下，用电热恒温水浴锅分别设20、30、40、50、60、70、80 ℃处理，每隔1 h 取样1 次，用自来水冷却至室温，迅速测定波长530 nm 处的吸光值（A530），连续监测7 h，并观察溶液颜色的变化。

3）pH 对色素颜色呈现的效应。取1 mL 提取液于具塞试管，分别加入pH 为0 ～8 的HCl 溶液9 mL，摇匀后于黑暗中平衡2 h，在400 ～700 nm 范围内扫描，检测溶液在可见光区的最大吸收波长（λvismax）处的吸光值（Aλvismax）。其中，pH0的HCl 为1.00 mol/L，pH1.0 的HCl 为0.10 mol/L，pH2.0 的HCl 为0.01 mol/L，pH 为3 ～8 的HCl溶液使用磷酸氢二钠和柠檬酸的缓冲液进行配制。

4）化学成分对色素颜色呈现的效应。取1 mL 提取液于具塞试管，均加入9 mL 反应液，混匀后在黑暗中平衡1 h，观察溶液颜色，检测波长 530 nm 处的吸光值（A530）。以“反应液+蒸馏水”为对照。反应液包括浓度均为0.5 mol/L 的

Al3+（AlCl3·6H2O）、Fe3+（FeCl3·6H2O）、Cu2+（CuSO4·5H2O）、Zn2+（ZnSO4·7H2O）、Mg2+（MgSO4）、Fe2+（FeSO4·7H2O）、Ca2+（CaCl2）、K+（KCl）、Na+（NaCl）和Mn2+（MnSO4·H2O），以及不同质量分数的氧化剂（H2O2）、还原剂（维生素C 和Na2SO3）、葡萄糖、蔗糖、柠檬酸等。

1.3 数据处理

用Excel 2007 软件对数据进行基础处理，用SPSS 22.0 统计软件对试验结果进行显著性检验和方差分析。

2 结果与分析

2.1 香水莲花花色素苷的提取条件

2.1.1 最大吸收波长

以香水莲花花色素苷提取液吸收的波长为横坐标，以不同波长下吸光值为纵坐标，香水莲花花色素苷提取液在波长400 ～700 nm 处的紫外-可见光谱如图1 所示。由图1 可看出，紫色香水莲花和粉色香水莲花花色素苷提取液在波长530 nm 附近均有1 个吸收峰。花青素在可见光区域最大吸收波长为500 ～550 nm[17]，因此，香水莲花花色素苷符合花青素类物质的特征吸收峰，故可初步断定是花青素类物质。

图1 香水莲花花色素苷提取液紫外-可见光吸收光谱Fig.1 The ultraviolet-visible spectrum of different color pigments in N.hybrid

2.1.2 适宜的提取溶剂

香水莲花在不同提取溶剂下的吸收光谱如图2 所示。由图2 可看出，紫色香水莲花和粉色香水莲花花色素苷提取液以0.1 mol/L 的盐酸为提取溶剂的吸收峰值波长均约在530 nm 处，吸光峰值分别为0.145、0.180，提取液呈淡粉红色；以1%盐酸甲醇和1%盐酸乙醇为提取溶剂的吸收光谱基本一致，在波长530 nm 处均有1 个较大的吸收峰值，紫色香水莲花花色素苷提取液在可见光区最大吸收峰分别为0.213 和0.202，粉色香水莲花花色素苷提取液在可见光区最大吸收峰分别为0.295和0.215，这正是花色素苷的特征吸收峰。紫色香水莲花色素苷提取液在1%盐酸甲醇提取溶剂中呈深紫红色，在1%盐酸乙醇提取溶剂中呈深红色，粉色香水莲花色素苷提取液在2 种提取溶剂中分别呈深粉红色和粉红色，与花瓣颜色类似。因此，在提取香水莲花花瓣中花色素苷时，可选择1%盐酸甲醇为提取溶剂。

2.1.3 适宜的提取时长

不同提取时长对2 种香水莲花花色素苷提取效果的影响如图3 所示。由图3 可看出，浸提时长在6 h 内时，随着提取时长的延长，香水莲花花色素苷含量显著增加；在提取时长达到6 h 时，花色素苷含量达到最高值；之后，随着浸提时长继续延长，2 种香水莲花的花色素苷含量均趋于相对稳定，提取时长达10 h 后，含量逐渐下降，可能是因为提取时长过长，花色素产生了分解。因此，在香水莲花花色素苷提取及其稳定性的研究中，浸提时长选用6 h 较为合适。

图2 不同提取溶剂中香水莲花花色素苷提取液吸收光谱Fig.2 The ultraviolet-visible spectrum of anthocyanin in N.hybrid in different extraction solutions

图3 不同提取时长下香水莲花花色素苷的含量Fig.3 The content of anthocyanin in N.hybrid under different extraction time

2.2 香水莲花花色素苷的稳定性

2.2.1 光照的影响

光照对香水莲花花色素苷稳定性的影响如图4 所示。由图4 可看出，光照对香水莲花花色素苷提取液产生褪色效应，光照越久，强度越大，花色素苷降解幅度越大。自然光和日光灯光均导致紫色和粉色香水莲花花色素苷的降解，具体表现为提取液颜色变淡，在波长530 nm 处的吸光值持续下降，其中，自然光的作用最强烈。在避光条件下，2 种香水莲花的花色素苷均较为稳定。光照处理8 h 后，紫色香水莲花在日光灯和自然光下花色素苷提取液吸光值比遮光条件下分别下降了20.0%和30.2%；粉色香水莲花花色素苷提取液吸光值分别下降了26.4%和37.0%，下降幅度较大。因此，香水莲花的花色素苷对光较为敏感，尤其是自然光，避光能够有效防止其花色素苷的降解，香水莲花花瓣的花色素苷类色素表现出光稳定性较差的显著特征。

图4 光照对香水莲花花色素苷稳定性的影响Fig.4 Effect of light on the stability of flower color pigment from N.hybrid

2.2.2 温度的影响

温度对香水莲花花色素苷稳定性的影响如图5 所示。由图5 可看出，香水莲花花色素苷的耐热性较差，温度升高会降低香水莲花花色素苷提取液的吸光值，使其颜色变淡，且温度越高，作用越明显。随着温度的升高和处理时长的延长，香水莲花花色素苷提取液在波长530 nm 处的吸光值不断下降，而且，温度越高，处理时长越长，其下降幅度越明显，香水莲花花色素苷提取液的颜色则更淡。处理7 h 后，在80 ℃条件下紫色香水莲花和粉色香水莲花的花色素苷提取液吸光值比20 ℃条件下分别下降了35.0%和45.2%，说明粉色香水莲花的花色素苷受温度影响更大。

香水莲花花色素苷在不同温度下发生的变化，可能是因为温度影响其花色素苷与辅色素的共色作用，高温也会导致花色素苷向无色的查尔酮转变。

图5 温度对香水莲花花色素苷稳定性的影响Fig.5 Effect of temperature on the stability of flower color pigment from N.hybrid

2.2.3 pH 的影响

pH 对香水莲花花色素苷稳定性的影响见表1。由表1 可知，不同pH 使香水莲花花色素苷的颜色产生不同程度的变化。在强酸性条件下，随着酸性减弱，香水莲花花色素苷提取液的吸光值不断减小，当pH 为5 时，吸光值最低，与pH0 ～2 时的吸光值差异极显著。在弱酸条件下（pH4 ～6），提取液的吸光值较低，说明弱酸性环境会使香水莲花的花色素苷提取液褪色。在中性环境中，提取液的吸光值逐渐增大。从吸光值的总体变化趋势可以看出，酸性环境对香水莲花花色素苷的影响较大，酸性增强，香水莲花花色素苷稳定性较好，提取液颜色加深；弱酸环境不利于香水莲花花色素苷的稳定，在中性的环境中，其色素又较为稳定。

表1 pH 对香水莲花花色素苷稳定性的影响†Table 1 Effect of pH on the stability of flower color pigment from N.hybrid

2.2.4 金属离子的影响

金属离子对香水莲花花色素苷稳定性的影响见表2。由表2 可知，不同金属离子对香水莲花花色素苷的影响存在差异。Al3+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、K+、Na+、Mn2+对香水莲花花色素苷的影响不大，提取液的颜色和吸光值均无极显著变化；Cu2+使提取液呈现蓝紫色；Fe3+使提取液由紫红色或粉红色转为黄棕色；Fe2+使紫色香水莲花和粉色香水莲花的花色素苷提取液分别变为紫黑色和蓝黑色。说明Cu2+、Fe3+和Fe2+这3 种金属离子对香水莲花花色素苷的影响较大，使其提取液呈现出不同的颜色。其原因可能是这几种金属离子与香水莲花花色素苷发生了化学反应，从而使其褪色或转变为其他颜色的物质。所以，在储存或生产香水莲花花色素苷时，尽可能避免与Cu2+、Fe3+和Fe2+等金属离子相接触。

表2 金属离子对香水莲花花色素苷稳定性的影响Table 2 Effect of metal ions on the stability of flower color pigment from N.hybrid

2.2.5 氧化剂和还原剂的影响

氧化剂和还原剂对香水莲花花色素苷稳定性的影响见表3。由表3 可知，随着氧化剂和还原剂质量分数的提高，2 种香水莲花花色素苷提取液的吸光值均不断减小。氧化剂H2O2质量分数为1.0%时，2 种香水莲花的花色素苷提取液均转为无色，吸光值显著降低。还原剂Vc 使香水莲花花色素苷提取液颜色变淡，吸光值随其体积分数的增大而下降。还原剂Na2SO3（也可作为防腐剂）对香水莲花花色素苷破坏性较大，低质量分数溶液（0.1%）即可使其吸光值迅速下降，且提取液的颜色由红褪为无色；在质量分数为0.5%时，提取液为极浅黄色；在质量分数为1.0%时，提取液变为浅黄色，且 2 种香水莲花对应的吸光值均发生显著下降。说明，香水莲花花色素苷对氧化剂和还原剂较为敏感。

2.2.6 糖和柠檬酸的影响

糖和柠檬酸对香水莲花花色素苷稳定性的影响见表4。由表4 可知，紫色香水莲花和粉色香水莲花花色素苷提取液在葡萄糖、蔗糖和柠檬酸溶液中分别呈紫红色和粉红色。随着蔗糖质量分数的升高，花色素苷提取液的吸光值不断减小，质量分数3% 与质量分数1% 条件下吸光值的差异极显著，颜色变淡。不同质量分数的葡萄糖溶液对香水莲花花色素苷的影响不明显，提取液的吸光值变化不大。随着柠檬酸质量分数的升高，香水莲花花色素苷提取液的吸光值有所增加，质量分数2%、3% 与质量分数1% 条件下吸光值的差异显著。由此可见，蔗糖和葡萄糖对香水莲花花色素苷的影响存在差异，葡萄糖对花色素苷提取液的颜色几乎不产生影响，而蔗糖会使其颜色偏淡。柠檬酸则可以维持花色素苷提取液的颜色，且随柠檬酸质量分数增加，花色素苷更为稳定。

表3 氧化剂和还原剂对香水莲花花色素苷稳定性的影响Table 3 Effect of oxidant, reductant on the stability of flower color pigment from N.hybrid

表4 糖和柠檬酸对香水莲花花色素苷稳定性的影响Table 4 Effect of sugar and citric acid on the stability of flower color pigment from N.hybrid

3 结论与讨论

不同植物的叶片、花瓣或果实中花色素苷的最佳提取条件不同[18]。在对香水莲花花色素苷提取条件的研究中发现，1%盐酸甲醇和1%盐酸乙醇的提取效果比0.1 mol/L 盐酸的提取效果好，且1%盐酸甲醇的提取效果要优于1%盐酸乙醇，这与橡胶树叶片中花色素苷的提取效果相似[19]。因此，在进行香水莲花花色素苷提取时，选用1%盐酸甲醇作为提取溶剂，提取6 h，可以充分提取花瓣中的花色素苷。

环境因素会影响植物花色素的稳定性，这在一定程度上限制了花色素的应用[20]。因此，研究植物中天然色素的性质，选择使其稳定的因素，有利于天然花色素的开发和利用[21]。花色素苷颜色的稳定性受pH、氧气、温度、花色素苷浓度和结构、光、酶，以及其他辅助因素的影响[22]。当植物的外界环境发生变化时，其组织也可能产生相应的变化，植物本身所呈现的颜色就会发生改变。在本研究中，香水莲花花色素苷属于花色苷类色素，色素稳定性受诸多理化因素的影响。

香水莲花花瓣花色素苷对光和热较为敏感。光照和高温可以使香水莲花花色素苷发生降解，且光照越强，温度越高，色素的降解幅度越大。因此，适当的低温和避光条件能较好地维持香水莲花花色素苷的稳定性。在研究香水莲花花瓣花色素苷时，整个提取过程要尽量避光，同时还应注意温度要求，这与刘晓东等[23]对紫叶风箱果叶片花色素苷稳定性的研究结果相似。而杨晓娜等[24]对紫皮石斛色素的研究得出相反的结论，其花色随温度的增高而加深，花色苷通过分子自聚作用而使其颜色增强，说明不同植物花色苷受温度的影响不同。

香水莲花花瓣花色素苷的颜色受介质pH 影响产生不同的变化。在本研究中，随酸性增强，香水莲花花色素苷稳定性较好，颜色加深；而弱酸环境不利于香水莲花花色素苷的稳定；在中性环境中，香水莲花花色素苷又趋于稳定。杨科家等[25]在对元宝枫叶片花色素苷的研究中，也发现酸性环境有利于提高花色的稳定性。因此，在较低的pH 环境中，可以保持香水莲花花瓣花色素苷颜色的稳定性。花色素对氧化还原作用较为敏感，这在较大程度上限制了其在生产中的应用[26]。在本研究发现，香水莲花花色素苷的稳定性随氧化剂和还原剂浓度的提高而不断下降，产生褪色反应。相似结果在欧洲卫矛叶片花色素苷的研究中也得到了证实[27]。Cu2+、Fe3+和Fe2+对香水莲花花色素苷的影响较大，可能是因为花色素苷与这类金属离子形成了络合物，从而改变其颜色。葡萄糖对花色素苷的颜色几乎不产生影响，而蔗糖会使花色偏淡，柠檬酸则可以维持花色，且随柠檬酸浓度增加，花色更为稳定。在黄刺玫花色素稳定性的试验中，昝立峰等[28]却发现蔗糖、柠檬酸等食品添加剂对色素的稳定性无显著影响，色素颜色未发生变化，与本研究中结果存在差异。

在不同的生长周期，植物体内的花色素苷含量会发生变化，从而影响其呈色[29]。在适宜的生长环境内，香水莲花能全年开花，花量大，花色多变，资源丰富。本研究中仅选择香水莲花盛花期的花瓣进行了研究，后续可对其不同生长周期内天然色素的稳定性进行系统研究，也可从其色素的化学成分、生理活性以及毒理学等方面进一步研究，以充分挖掘香水莲花的潜在利用价值。香水莲花花色素可以作为酸性食品、冷饮食品及化妆品等的天然添加剂加以开发利用。在应用其花色素时，要注意避免强光和高温，避免接触铜铁离子及氧化剂和还原试剂。