新型对香豆酰氨基酸乙酯的合成与抗氧化活性

王 东, 翟文丽, 肖 潇, 穆凯代斯·太外库力, 祝 钧,2*

(1.北京工商大学 理学院，北京 100048; 2.中国轻工业化妆品重点实验室，北京 100048)

过量自由基会加速食品中脂类的氧化，降低食品质量和消费者的接受度[1]。抗氧化剂可减少慢性疾病(如DNA损伤、突变、致癌)的发生，这通常与生物系统中自由基传播的终止有关[2-3]。因此，筛选高效的抗氧化剂对减少自由基损害有积极意义。

对香豆酸(p-CoA)，属于天然存在的简单酚酸化合物[4]，主要分布在植物中[5-6]，具有抗菌[7]、抗氧化[8]、抗病毒[9]等多种生物活性，在食品和药品领域有广泛应用[10-11]。p-CoA由于溶解性、稳定性较差[10]，进一步应用受到限制。对香豆酸酰胺是p-CoA的重要衍生物，自然界中对香豆酰胺衍生物的提取纯化过程较复杂。Fu等[12]将p-CoA与3-甲基-2-烯胺在苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)耦合剂下生成(E)-N-乙基-3-(4-羟基苯基)丙烯酰胺，并证实了化合物的抗菌能力。Stankova等[13]以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与4-二甲氨基吡啶(DMAP)作催化剂，p-CoA在二甲基甲酰胺(DMF)中与缬氨酸噻唑反应，合成了对香豆酰缬氨酸噻唑型酰胺。活性测试结果表明，化合物具有清除DPPH自由基活性及抗流感病毒功效。

氨基酸常具有多种生物活性，如缬氨酸和酪氨酸具有抗菌作用[14]，赖氨酸和精氨酸具有抗氧化作用[15]。Noh等[16]利用曲酸与氨基酸结合，发现与氨基酸结合后的曲酸对酪氨酸酶的抑制率明显强于曲酸单体。

受此启发，本文采用EDC法，以p-CoA和3种氨基酸乙酯盐酸盐为原料，合成了对香豆酰缬氨酸乙酯(a)、对香豆酰亮氨酸乙酯(b)和对香豆酰蛋氨酸乙酯(c)，目标化合物均为新化合物(Scheme 1)，其结构经1H NMR, IR和MS(ESI)表征。并利用体外清除DPPH自由基和羟基自由基实验研究了目标产物抗氧化活性。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker AV 600 MHz型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标)；Nicolet IS10型傅里叶变换红外光谱仪(KBr压片)；LC201-AB SCIEXAP13200型液质联用仪。

p-CoA、L-亮氨酸乙酯盐酸盐、L-缬氨酸乙酯盐酸盐、L-蛋氨酸氨酸乙酯盐酸盐、EDC、1-羟基苯并三唑(HOBt)，北京伊诺凯科技有限公司；1，1二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)；菲啰啉，北京化玻站生物分析技术有限公司；其余所用试剂均为分析纯。

1.2 a～c的合成(以b为例)[17]

将p-CoA 1.354 g(8.25 mmol)、L-亮氨酸乙酯盐酸盐1.614 g(8.25 mmol)和HOBt 1.15 g(8.5 mmol)溶解于DMF(25 mL)中，冰浴冷却下，搅拌10 min；缓慢滴加三乙胺3.45 mL(24.75 mmol)，滴毕，搅拌反应10 min；撤去冰浴，加入EDC 1.6 g(8.35 mmol)，搅拌下于30 ℃反应20 h。加入100 mL蒸馏水，用乙酸乙酯(150、100、50 mL)萃取，收集有机相，用饱和食盐水(2×50 mL)洗涤，回收有机相，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，滤液浓缩，残余物蒸除溶剂后经硅胶柱层析(洗脱剂：A=乙酸乙酯/石油醚=2/3，V/V)纯化得白色粉末状固体b2.0624 g，收率81.98%, m.p.99～102 ℃;1H NMRδ: 9.86(s, 1H, OH), 8.31(d,J=7.7 Hz, 1H, NH), 7.43～7.37(m, 2H, ArH), 7.34(d,J=15.7 Hz, 1H, CH=C), 6.82～6.76(m, 2H, ArH), 6.48(d,J=15.7 Hz, 1H, C=CH), 4.38(ddd,J=10.0 Hz, 7.8 Hz, 5.1 Hz, 1H, CH), 4.09(qd,J=7.1 Hz, 1.1 Hz, 2H, OCH2), 1.70～1.62(m, 1H, CH), 1.62～1.49(m, 2H, CH2), 1.19(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3), 0.91(d,J=6.6 Hz, 3H, CH3), 0.87(d,J=6.5 Hz, 3H, CH3); IRν: 3340.59(N—H), 1714.89(C=O), 1212.04(C—O), 1194.69(C—O)cm-1; MS(ESI)m/z: 306.18{[M+H]+}。

用类似的方法合成a和c。

a：收率43.2%，淡黄色固体粉末, m.p.141～143 ℃;1H NMRδ: 9.85(s, 1H, OH), 8.19(d,J=8.2 Hz, 1H, NH), 7.43～7.37(m, 2H, ArH), 7.34(d,J=15.7 Hz, 1H, CH=C), 6.84～6.76(m, 2H, ArH), 6.62(d,J=15.8 Hz, 1H, C=CH), 4.28(dd,J=8.2 Hz, 6.2 Hz, 1H, CH), 4.18～4.06(m, 2H, OCH2), 2.13～2.02(m,J=6.8 Hz, 1H, CH), 1.20(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3)，0.91(dd,J=10.4 Hz, 6.8 Hz, 6H, CH3+CH3); IRν: 3356.98(N—H), 1731.76(C=O), 1199.51(C—O), 1173.95(C—O)cm-1; MS(ESI)m/z: 292.02{[M+H]+}。

c：收率47.6%，淡黄色固体粉末, m.p.109～111 ℃;1H NMRδ: 9.86(s, 1H, OH), 8.37(d,J=7.6 Hz, 1H, NH), 7.44～7.37(m, 2H, ArH), 7.35(d,J=15.7 Hz, 1H, CH=C), 6.83～6.76(m, 2H, ArH), 6.48(d,J=15.7 Hz, 1H, C=CH), 4.47(ddd,J=9.1 Hz, 7.6 Hz, 4.9 Hz, 1H, CH), 4.11(qd,J=7.1 Hz, 2.5 Hz, 2H, OCH2), 2.58～2.50(m, 2H, CH2), 2.05(s, 3H, SCH3), 2.10～1.87(m, 2H, SCH2), 1.19(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3); IRν: 3316.96(N—H), 1737.07(C=O), 1211.08(C—O), 1173.95(C—O)cm-1; MS(ESI)m/z: 324.21{[M+H]+}。

1.3 活性测试

DPPH自由基清除作用[18]：待测样品用无水乙醇溶解，配制不同浓度。取0.5 mL待测液与2.5 mL DPPH·(2×10-4mol/L)乙醇溶液混合摇匀，避光放置30 min，在波长517 nm处测定吸光度。

羟基自由基清除作用[19]：取200 μL 0.75 mM菲啰啉乙醇溶液，依次加入400 μL磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH = 7.4)和200 μL待测液混合摇匀，加入200 μL 0.75 mM 硫酸亚铁溶液，混匀，加入200 μL 0.01%双氧水，于37 ℃水浴1 h，在波长536 nm处测量吸光度，并计算羟基自由基抑制率。

2 结果与讨论

2.1 合成[17,20]

采用三因素三水平的正交实验优化了b的合成条件，因素水平见表1。由正交实验结果可知，因素对反应收率的影响为C>B>A，最优反应条件为A2B2C2，即反应温度为30 ℃，反应时间为20 h，反应溶剂为DMF。

表1 正交实验的因素和水平

2.2 自由基清除活性

对香豆酰氨基酸乙酯清除自由基结果见表2，各物质清除自由基能力由强到弱的顺序为：c>b>p-CoA>a。与对香豆酸单体相比较，化合物b和c清除自由基活性明显增强(P<0.05)。各化合物清除自由基能力的与其侧链氨基酸基团有关(蛋氨酸乙酯>亮氨酸乙酯>缬氨酸乙酯)。在生物膜系统中，抗氧化活性不仅与羟基的数量有关，还取决于化合物本身的溶解度，疏水性(或分配系数，logP)[3]。3种化合物结构相似，b比a多了一个亚甲基，与c相比用硫原子取代了碳元素并变换了空间构型，不同氨基酸的疏水值不同(缬氨酸>亮氨酸>蛋氨酸)[22]，推知氨基酸疏水值越小，清除自由基能力越强。表明氨基酸基团对于对香豆酰胺酯类物质的抗氧化性影响显著。

表2 自由基清除活性

3 结论

合成了3种新型对香豆酰氨基酸乙酯(a～c)，并进行了初步体外活性测试。结果表明：b和c对DPPH半数抑制浓度(IC50)分别为79.67±0.51、71.72±0.51 mmol/L，显著高于p-CoA(88.51±0.50 mmol/L)(p<0.05)；a、b和c对羟自由基的抑制率分别为25.71±3.4%、37.38±0.6%、44.72±1.5%，显著强于同浓度p-CoA(8.15±0.6%)(p<0.05)。