LncRNA WTAPP1在血管内皮祖细胞成血管中的作用及机制研究

陈一彪，明志兵，梁火奇，于晓强，夏春秋

急性心肌梗死（AMI）是一种严重危害人类健康的心血管疾病，已成为“人类健康第一杀手”，是全世界范围内的主要死亡原因[1,2]。血管内皮祖细胞（EPCs）是存在于骨髓中的多能干细胞，具有促进血管生成和修复内皮的功能[3,4]。研究表明，EPCs可通过促进血栓再通和血管生成，降低心肌梗死面积，改善左室功能。然而，高龄、吸烟、肥胖和糖尿病等心血管危险因素可损害EPCs的成血管功能，降低EPCs成活率，不利于AMI后的血管再通[5]。因此，提高EPCs的成血管能力对于改善AMI患者预后显得尤为重要。

长链非编码RNA（LncRNA）是非编码RNA中的一种，其长度大于200 nt[6]。LncRNA在调控细胞的增殖、周期、分化和排列中发挥重要的作用。研究表明，LncRNA具有调控血管生成、改善心肌梗死的作用[7,8]。LncRNA WTAPP1是新近发现的LncRNA，被预测具有促血管生成作用[9]。然而，尚不清楚LncRNA WTAPP1是否通过调控EPCs，发挥促血管生成效应。因此，本研究通过慢病毒感染，探讨LncRNA WTAPP1过表达对EPCs增殖活性和成血管能力的影响，以期为AMI患者的精准治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料外周血取自健康志愿者。LncRNA WTAPP1慢病毒载体由上海吉凯基因工程技术有限公司构建和鉴定。EGM-2MV细胞培养购自美国Gibco公司。四甲基偶氮唑蓝（MTT）试剂盒和流式周期试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2 EPCs的分离、培养和转染经外周静脉抽取健康成人50 ml静脉血，加入到含人淋巴细胞分离液的离心管中，3000 rpm离心20 min。吸取中间的白色云雾层，加入等体积PBS，清洗后离心。加入PBS以重悬细胞，将EPCs接种于EGM-2 MV完全培养基，置于5% CO2培养箱中，37℃下培养。鉴定后将LncRNA WTAPP1转染EPCs，接种于培养皿中，将细胞分为三组：对照组、空载体组和转染组。

1.3 qRT-PCR法检测LncRNA的表达移除上清液，提取细胞总RNA，将RNA反转录成cDNA，扩增后以U6作为参照物，检测LncRNA WTAPP1的表达。LncRNA WTAPP1上游引物序列为5'-CA AATCTGTGACAATGCCCC-3'，下游引物序列为5'-GTTATGACTCAAGCGAAAATGG-3'。U6上游引物序列为5'-GTGCTCGCTTCGGCAGCAC-3'，下游引物序列为5'-AAAAATATGGAACGCTCAC-3'。

1.4 MTT法检测细胞增殖活性将处理后的细胞接种到96孔板，移除上清液，每孔加入5 g/L的MTT，孵育后移除上清液，加入二甲基亚砜溶液，孵育10 min。检测490 nm波长下各组细胞的吸光度值（OD值），计算存活率，细胞存活率（%）=处理组OD值/正常组OD值×100%。

1.5 细胞侵袭实验待细胞培养至对数生长期，胰酶消化后重悬，调整细胞浓度为2×105/ml。将Matrigel胶加入Transwell板底部，待胶固话后，将150 μl的细胞悬液加入Transwell板上室，同时向下室加入600～800 μl的EGM-2MV培养基，孵育24 h。取出Transwell小室，用棉签拭去Matrigel胶和小室底部粘附的细胞，将小室移到预先配置的0.2%结晶紫染液的孔中，室温孵育10 min。清洗后用中性树胶封片，显微镜下观察。

1.6 体外成管实验待细胞培养至对数生长期，胰酶消化后重悬，调整细胞浓度为2×105/ml。将Matrigel胶加入到预冷的96孔培养板中，待Matrigel胶铺平后将100 μl的细胞悬液加入到培养板中，培养24 h后置于光学显微镜中观察。

1.7 统计学方法采用所有数据均采用SPSS 21.0统计学软件分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间均数的比较采用t检验，多组间均数的比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA WTAPP1的表达RT-PCR检测结果显示，转染后LncRNA WTAPP1表达水平显著上调，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

2.2 细胞增殖活性比较MTT实验结果显示，转染组细胞生长速度明显高于对照组和空载体组，差异有统计学意义（P＜0.05），而对照组和空载体组间的差异无统计学意义（P＞0.05）（图2）。

2.3 侵袭能力比较Transwell结果显示，转染组细胞的侵袭能力明显高于对照组和空载体组，差异有统计学意义（P＜0.05），而对照组和空载体组间的差异无统计学意义（P＞0.05）（图3～4）。

图1 各组细胞LncRNA WTAPP1的表达水平（n=6）

图2 MTT法检测LncRNA WTAPP1过表达对EPCs增殖活性的影响（n=6）

2.4 成管能力比较成管实验结果显示，转染组细胞的成管能力明显高于对照组和空载体组，差异有统计学意义（P＜0.05），而对照组和空载体组间的差异无统计学意义（P＞0.05）（图5～6）。

图3 Transwell检测LncRNA WTAPP1过表达对EPCs侵袭能力的影响（200×视野下）

图4 Transwell各组细胞统计图

3 讨论

图5 成管试验检测LncRNA WTAPP1过表达对EPCs成管能力的影响（200×视野下）

图6 各组细胞成管数统计图

据统计，全世界每年有超过1700万人死于心血管疾病，其中一半以上死于AMI。近年来，随着社会经济的快速发展、城镇化和人口老龄化的加剧，我国AMI的发病率和死亡率呈逐年上升态势。《中国心血管报告2018》指出，我国心血管病现患人数2.9亿，其中AMI患者超过250万[10]。支架置入、药物溶栓和外科血管搭桥等治疗手段可部分恢复梗死区的血氧供应，挽救濒临死亡的心肌，改善AMI患者预后。但仍有许多患者未能及时进行血运重建，导致心肌出现不可逆坏死和凋亡，最终引起心室重构和心力衰竭[11]。因此，需要新的治疗策略来保护缺血心肌，延缓甚至逆转AMI和梗死后心室重构，预防心力衰竭的发生。

EPCs是来源于骨髓的成熟血管内皮细胞前体，具备自我更新和分化的能力，在一定条件下可诱导分化为血管内皮细胞[4,12]。研究表明，在急性心肌缺血的情况下，EPCs可被快速动员，进入梗死的心肌组织，通过促进血栓再通和血管生成，降低心肌梗死面积，改善左室功能[13]。然而，由于人体内的EPCs数量有限，即使被从骨髓动员到外周血循环中，其转移、迁徙、进入受损组织的数量远远不能满足治疗的需求。因此，寻找提高EPCs增殖和成血管能力的有效方法对于治疗和改善AMI患者的预后具有重要的临床意义。

LncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，在表观遗传、核酸转录及转录后翻译水平调控细胞的增殖、转移及侵袭等代谢活动[14]。研究表明，LncRNA参与调控多种心血管发育以及疾病的发展过程，其表达水平与动脉粥样硬化、AMI及心力衰竭等的发生、发展密切相关。LncRNA WTAPP1位于11号染色体上，序列名ENST00000544704。Qian等[15]通过人类LncRNA芯片和生物学信息分析发现，LncRNA WTAPP1具有促血管生成作用。目前文献中对LncRNA WTAPP1的报道较少，其生物学功能和对EPCs成血管功能的调控作用尚不清楚。

本研究首先利用慢病毒转染，在EPCs中过表达LncRNA WTAPP1，并通过RT-PCR验证转染效率。结果表明，转染后LncRNA WTAPP1表达水平显著上调。此外，MTT实验结果显示，与对照组和空载体组相比，LncRNA WTAPP1转染组的增殖活性显著提高；进一步的研究表明，过表达LncRNA WTAPP1的EPCs具有更强的侵袭能力和成管能力。上述结果提示过表达LncRNA WTAPP1可显著提高EPCs的增殖活性、侵袭和成血管能力。

综上所述，本研究结果表明，过表达LncRNA WTAPP1可增强EPCs增殖活性、侵袭和成血管能力。本研究为AMI的防治提供了新的靶点和理论依据。然而，本研究仍有不足之处：没有进行在体动物实验，缺乏体内实验数据。因此，这些不足将是我们接下来研究的重点。