金黄色葡萄球菌生物膜防治研究进展

2021-01-04郑杨查何

中国医药导报 2021年18期

郑杨查何

遵义医科大学第三附属医院检验科，贵州遵义 563000

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是医院感染的关键病原体，可引起从轻微浅表感染到毒素相关疾病，甚至危及生命的侵袭性感染。在美国，每年有275 000 人因耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）感染住院，多达19 000 人死亡[1]。抗生素被用作抵抗SA 感染的主要武器，但在他们的高选择压力下及不当使用下导致耐药细菌的出现和流行，其中生物膜形成是SA 的主要耐药机制之一。其次，SA 容易在人工装置上形成生物膜，是慢性感染存在的关键因素。生物膜的形成使得SA 致病性和耐药性明显增强，能够抵抗吞噬细胞的攻击，对某些抗生素不具有渗透性或延缓渗透，且生物膜中的细菌不同于浮游状态，含有更多对抗生素不敏感的休眠细胞，这种效应使该细胞亚群能够承受远高于最低抑菌浓度时抗生素的抑菌效果[2]。尽管新型抗生素仍在持续开发，但它的发现也变得越来越困难[3]，迫切需要替代的抗生物膜治疗策略。本文对近年SA 生物膜的几大防治策略进行综述。

1 SA 生物膜的形成

生物膜的形成是以初始黏附、增殖、成熟和扩散4 个阶段为主的动态过程[4]。首先，浮游细菌的表面附属物可逆附着，接着细胞外基质（extracellular matrix，ECM）导致不可逆附着；其次，细胞增殖形成微菌落；然后，生物膜生长和细胞分化，形成多层细胞簇，从而获得由细胞、基质和水道组成具有复杂三维结构的成熟生物膜；最后，细胞根据生物膜中的条件主动或被动地从生物膜分离、分散和定殖在其他表面或返回浮游状态[5]。

2 SA 生物膜的结构

生物膜是由ECM 及内部浮游细菌组成的有组织的集合。ECM 由多糖、蛋白质和胞外DNA（eDNA）等成分组成[5]。多糖被称为多糖细胞间黏附素（PIA），对生物膜的建立和维持起到重要作用。SA 表面蛋白如自溶蛋白AtlA 通过诱导eDNA 释放，促进细胞间聚集和附着。其他表面蛋白如蛋白A、纤连蛋白等均有助于生物膜基质的形成和稳定[6]。

3 SA 生物膜防治

3.1 新型抗生素

自然条件下，细菌以浮游和生物膜2 种生长形式存在，而抗生素选择的主要标准是对在浮游状态下的临床菌株进行药敏试验。与浮游菌比较，特殊的生物屏障作用极大地提高了细菌的耐药性，传统抗生素对生物膜的敏感性显著下降[7-8]，因此需要探索能够有效杀灭SA 生物膜的抗生素。达托霉素（Daptomycin）是一种新开发的环脂肽，通过快速去极化和中断DNA、RNA 和蛋白质合成来破坏细胞膜。其作用方式不要求细胞处于代谢活性状态，因此其是对抗深埋在生物膜基质中“持久性”细胞特别有效的药剂。研究发现，头孢洛林（Ceftaroline）的活性与Daptomycin 相当，在体内甚至更有效[9]，但另一项研究显示，其在亚抑菌浓度（MIC）下不能减少基质产生菌预形成的生物膜，对部分MRSA 菌株反而增强了生物膜形成。因此，保持抗生素有效杀菌浓度对抗MRSA 相关生物膜感染至关重要[10]。特拉万星（Telavancin，TLV）是一种新型糖肽抗生素，通过干扰肽聚糖的聚合和交联抑制细菌细胞壁的合成。此外，TLV 还与细胞膜中的脂质Ⅱ结合，导致细胞膜去极化和破坏细胞屏障功能，同样也不受细胞代谢活性的影响。TLV 表现出比万古霉素更强的抗MRSA 活性，对于耐万古霉素的MRSA 生物膜相关感染突显了开发新型抗生素的必要性[11]。因此，研发基于不同机制的新型抗生素势在必行。

单一抗生素对生物膜的作用极为有限，抗菌药物的联合应用可迅速增强抗菌活性，并有助于防止或延缓细菌耐药[12]。利福平是唯一在SA 中显示出高效和可靠抗生物膜活性的传统抗生素[7]，但易出现耐药性。奥利万星与利福平结合使生物膜细菌密度显著降低[13]，奥利万星通过抑制细胞壁合成、破坏菌膜完整性促进利福平进入细菌，其本身可抑制细菌RNA 合成而达到协同抗菌的作用。

3.2 新型抗生物膜药剂

3.2.1 酶酶可以通过降解SA 的细胞壁或ECM 来破坏生物膜的稳定性。①糖苷水解酶：通过靶向PIA 作为分散生物膜的手段。分散素B 水解β（1,6）糖苷键降解PIA，从而达到抑制SA 生物膜的作用[14]；溶菌酶通过催化肽聚糖的水解来破坏细菌细胞壁；藻酸盐裂解酶则能够降解构成基质的多糖藻酸盐发挥作用[15]。②蛋白水解酶：溶葡萄球菌酶一直是对抗MRSA 的重要临床研究对象，它能够裂解细菌细胞壁的交联五甘酸桥[16]；金属蛋白酶Aur 通过降解Bap 和聚集因子b破坏SA 生物膜[16]；ATP 依赖的蛋白酶ClpP 通过对Agr群体感应的调控[16]抑制生物膜的形成[18]，以上几种蛋白酶通过各自机制发挥抗生物膜作用。③脱氧核糖核酸酶：DNase-I 通过降解eDNA，抑制SA 的黏附和早期生物膜的形成，这种酶在临床已被用于治疗囊性纤维化[15-16,19-21]。Sugimoto 等[22]对细胞外基质的研究显示，不同于PIA 仅存在少数菌株，eDNA 存在于所有菌株中，因此，eDNA 可作为今后SA 生物膜根除策略的主要靶点。涉及酶干扰生物膜形成的策略除了通过降解生物膜基质成分，还可以使用氧化酶类，他们会产生干扰细菌附着及具有细胞毒性的过氧化氢及次卤代酸[15]。

酶与抗菌剂的结合既能有效分散生物膜，又能杀死嵌入ECM 中的菌落，与单用抗菌剂比较，其具有抗菌谱增加、毒副作用减少等优势。无花果蛋白酶通过破坏生物膜基质使SA 生物膜结构遭到破坏，同时增强抗生素对生物膜嵌入细胞的作用。研究发现，用1000 μg/mL 的无花果蛋白酶进行预处理显著降低环丙沙星和苯扎氯铵所需的抗菌浓度[23]。

3.2.2 再利用药物与新药开发比较，药物再利用的优势在于该药的安全性和药理学知识可供参考，减少了研发新药所需的时间、成本和风险。这些“非抗生素”尽管不是用来治疗细菌感染，但研究发现其具有抗菌、抗生物膜的特性[24]。抗真菌药卡泊芬净通过抑制N-乙酰葡萄糖胺酶及β-1，3-D-葡聚糖合酶的同源物，降低多糖浓度和聚合物从而减少ECM，分解SA生物膜[2]。布洛芬为非甾体类抗炎药，使细胞代谢失活和菌落计数减少，抑制细菌的初始黏附和生物膜的形成。在临床使用中，给药后布洛芬的血药浓度远低于研究中的最低MIC，但目前商业用途的布洛芬局部制剂浓度高于研究中所需的浓度。因此，布洛芬可先用作局部制剂中的防腐或消毒剂[25]。

单一使用常规抗生素很难完全杀死生物膜形式的细菌，药物重新利用和抗生素联合可有效提高疗效、降低单药的使用浓度。研究显示，类风湿药雷公藤红素、食品添加剂去甲二氢愈创木酸能在一定浓度下消除SA 已建立的生物膜。此外，可协同庆大霉素抗生物膜[26]。由于其不会对人类皮肤模型造成刺激，已在临床用于治疗SA 引起的表浅皮肤感染。总之，药物再利用是在相对较短的时间内有效治疗细菌感染的唯一可行选择[27]。

3.2.3 镓基疗法镓基疗法的基本原理在于破坏细菌铁代谢。镓和铁是非常相似的元素，含镓化合物利用细菌铁获取系统穿透细菌细胞壁。在细胞水平上镓与铁竞争，干扰铁的吸收、代谢。镓不能转移电子，也不能诱导氧化还原反应，从而阻碍细菌基本生命活动。细菌对镓不太可能产生抗性，因为如果细菌下调受体以减少镓的结合和吸收，铁的吸收也会减少[28]。

不同作用模式化合物多管齐下提供了协同抗菌作用的潜力。靶向细菌铁代谢的化合物去铁酮Def 和镓原卟啉GaPP 的组合，显示出更强的抗生物膜功效，且体外实验显示无细胞毒性[29]。在未来临床应用中，这种新颖的治疗组合在对抗SA 生物膜感染方面具有巨大潜力[29]。

3.2.4 植物性化合物植物性化合物具有抑制生物膜形成或破坏生物膜的能力。其优点在于来源广泛、价格低廉、不易耐药，具有很好的发展前景。山柰酚是一种黄酮类化合物，其通过降低SA 分选酶A 基因的活性和黏附相关基因的表达，抑制初始附着，影响SA生物膜的形成[5]。研究显示，丁香酚使SA 生物膜的含量和细胞活力显著降低，丁香酚是一种亲脂疏水化合物，透过细胞壁和细胞膜使细胞内物质泄漏，从而使细菌失去正常形态。从分子水平上分析，丁香酚可使对生物膜形成具有全局性影响的两基因表达降低，其分别为葡萄球菌辅助调节位点基因和调节PIA 合成的icaD 基因[30]。

药物联合应用使细菌不太可能同时对多种药物产生耐药[12]。植物提取物博拉维农B 抑制氟喹诺酮类药物环丙沙星的NorA 外排泵，通过药物的不断积累，抑制生物膜的形成。且博拉维农B 穿透SA 生物膜的ECM 抑制活菌，起到协同抗生物膜作用[31]。

3.2.5 噬菌体近年来噬菌体被考虑作为替代抗生物膜的疗法[32]。研究发现噬菌体内溶素LysK 可降解SA生物膜，内溶素通过降解细菌的细胞壁来杀死细菌，进一步分解构成生物膜重要结构的肽聚糖囊泡，从而破坏生物膜的完整性[33]。抗生素和噬菌体的结合疗法是另一种抗生物膜策略。Tagliaferri 等[32]用庆大霉素和噬菌体SA5 双重治疗金黄色葡萄球菌株PS80，庆大霉素导致SA 细胞呈现聚集表型，降低了生物膜的形成，同时也更易受噬菌体的攻击，避免了仅用噬菌体处理出现的噬菌体抗性细胞。

3.2.6 抗菌肽（AMPs）AMPs 除了具有抗菌特性外，近年来发现其具有抗生物膜活性而作为治疗感染的新途径。最早发现人类AMPs LL-37 的某些肽通过穿透ECM 和杀死包埋细菌的方式造成生物膜的扩散[34]。SA1018 为一种合成的牛抗菌肽，它能触发（p）ppGpp细菌严格响应信号的降解，有效破坏已建立的SA 生物膜。但目前AMPs 造成生物膜扩散的机制尚不明确，需进一步研究[16]。

抗生素与AMPs 的联用是一种新颖的治疗方法。研究显示，新型合成抗菌抗生物膜肽与替考拉宁联用可清除99%生物膜包裹的细菌[35]。