外泌体在骨骼肌损伤修复中的研究进展

周 敏 李秉枢 刘 成 洪莎莎 胡 鸣 闵 洁 汤剑明 洪 莉

武汉大学人民医院妇产科，湖北武汉 430060

骨骼肌损伤是一种常见的临床损伤性疾病，通常是由外力直接作用导致骨骼肌纤维挫伤和撕裂或间接作用牵拉损伤肌纤维所致。骨骼肌损伤后修复不良可造成机体肌肉功能障碍，严重影响患者的日常生活。目前，关于骨骼肌损伤性疾病的治疗方法均存在明显的问题，因此迫切需要探索更有效的新型疗法[1]。外泌体是一类由细胞分泌的纳米级胞外囊泡，因其在不同生理状态下差异性携带内容物，近年来在疾病诊断与治疗领域的应用备受关注。研究表明，外泌体参与骨骼肌纤维的正常生长发育和损伤后再生过程，可作为骨骼肌损伤性疾病的一种新型疗法，不仅能取得较好的治疗效果，还可以避免并发症[2-3]。本文总结了外泌体在骨骼肌损伤修复领域的国内外最新研究成果，从外泌体的生物学特性、功能及在骨骼肌损伤性疾病中的应用进行综述。

1 外泌体生物学特性及功能

外泌体是一种粒径在30～150 nm 之间的脂质双层膜胞外囊泡，存在于多种哺乳动物细胞及体液[4]。外泌体内富含核酸、蛋白质、脂质及氨基酸和代谢产物。2007 年Valadi 等[5]首次发现外泌体内含有生物活性的信使RNA（mRNA）和微小RNA（miRNA/miR），将小鼠来源的外泌体与人细胞系共培养，结果在人细胞系中检测到一些小鼠蛋白，而这些蛋白在小鼠外泌体中仅以mRNA 的形式存在，表明mRNA 通过外泌体转移到受体细胞且被翻译成蛋白质[6]。因此，外泌体被认为是一种新型的分子水平转移媒介，可以将其载荷的内容物运输到靶细胞且影响受体细胞的功能，在细胞间“通讯”中发挥重要作用。

外泌体具有非常重要的临床应用价值。首先，外泌体可作为一种新型的疾病预测及诊断手段。随着生理状况的变化，外泌体分泌量及其内容物会显著不同，根据其内特定的蛋白或miRNA 可预测、诊断及预后疾病[7]。研究者已证实通过检测血清外泌体miR-1246 水平可诊断侵袭性前列腺癌及预测该病情的进展[8]。其次，外泌体可作为药物的运输载体。由于外泌体的磷脂双层膜结构，其可以通过药物难以逾越的生物屏障，同时避免局部炎症和免疫排斥反应，将外泌体作为药物运输载体，既能实现临床疾病的靶向治疗，又可以延长药物的半衰期。目前，外泌体通过递送化学药物在癌症、炎症和神经系统疾病治疗领域的作用得到有效证实[9]。外泌体还可以通过携带特定RNA分子在基因水平治疗疾病。Tao 等[10]通过外泌体使沉默RNA 结合到肿瘤细胞，引起目标mRNA 沉默，抑制消化系统肿瘤的生长。由此，外泌体在临床治疗领域具有广阔的应用前景。

2 骨骼肌损伤修复的反应过程

骨骼肌损伤后的修复过程可分为两个阶段，即炎症反应与修复重建阶段。骨骼肌损伤初始为炎症反应阶段，一般是伤后第1～2 天，肌纤维变性、坏死和周围血管广泛破坏，促炎症反应调节物质包括炎症因子和趋化因子释放，促使外周循环中的中性粒细胞经血管内皮游出血管壁渗入受损区域，中性粒细胞进一步释放促炎症因子扩大炎症反应，同时募集促炎型巨噬细胞、调节性T 细胞等其他骨髓细胞浸润到损伤部位发挥吞噬作用清除受损肌纤维等坏死组织碎片，此外，成纤维细胞、成纤维脂肪祖细胞等细胞也参与初始炎症反应的清除过程[11-12]。炎症反应后为修复阶段，一般是伤后第3～6 天，免疫细胞分泌大量的细胞因子及大分子蛋白如生长因子、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）和ECM 重塑基质金属蛋白酶等，激活静息状态的卫星细胞（statellite cell，SCs），产生ECM 趋化片段，同时促炎型巨噬细胞转为抗炎型巨噬细胞，参与调控SCs 与成肌细胞增殖与分化[13-14]。SCs 激活、増殖和分化形成新的肌管，然后与存活肌纤维融合，修复损伤肌纤维，同时产生新的ECM 包括肌内膜、肌束膜和肌外膜[15]。若骨骼肌损伤严重且范围过大，损伤处可见结缔组织瘢痕形成和毛细血管再建，一般在损伤后第14 天，肌肉新生完成，再生骨骼肌成熟，ECM 经历重塑，瘢痕组织机化，骨骼肌损伤修复与再生完成[16]。

3 外泌体与骨骼肌损伤修复

骨骼肌的损伤修复中肌卫星细胞的激活和肌源性分化是决定肌肉再生的最重要阶段，此外细胞之间的相互作用同样对骨骼肌纤维的再生至关重要。研究表明，在小鼠急性肌肉损伤模型中，肌纤维损伤后的最初几小时以及损伤后的第5～7 天再生过程中循环外泌体均显著增加，并且证实外泌体主要由损伤的肌纤维和肌肉再生相关的其他细胞产生[17]。因此，不同来源的外泌体在肌肉损伤修复中不同阶段可能发挥着不可忽视的作用。目前，研究者对外泌体在骨骼肌损伤修复中的研究重点集中在其携带的内容物，因此主要从以下3 个方面进行阐述。

3.1 外泌体蛋白介导的骨骼肌损伤修复

骨骼肌损伤早期，肌膜破损后胞内发生一系列急性反应进行肌动蛋白重组和膜重塑以数分钟内辅助肌膜愈合，其中钙依赖性磷脂结合蛋白A1 是肌膜损伤修复的关键蛋白[18]。Bizzarro 等[19]证实外泌体内富含的钙依赖性磷脂结合蛋白A1 通过作用甲酰基肽受体刺激成肌细胞增殖从而修复骨骼肌质膜以促进肌肉损伤修复。除了对肌膜修复作用外，外泌体蛋白还在肌纤维损伤后的炎症与抗炎过程中发挥作用。炎症过程中伴随炎症因子释放增多，肌管富含肌生成抑制蛋白的外泌体分泌增加，外泌体通过携载的肌生成抑制蛋白抑制生肌决定因子和肌细胞生成素表达以及蛋白激酶B 和雷帕霉素靶蛋白介导的肌生成信号通路，同时增加成肌细胞环氧化酶2 的表达[20]。因此，在肌肉修复的早期炎症反应阶段，外泌体通过其内蛋白限制肌生成并促进炎症细胞清除受损组织。此外，再生抗炎阶段，损伤的肌纤维还可以自分泌外泌体进行修复。Forterre 等[21]发现，成肌细胞和肌管在肌肉分化过程中能够分泌外泌体，且肌管释放的外泌体中富含丝蛋白和肌联蛋白等多种蛋白，随后体外实验研究表明氧化损伤的肌管会释放外泌体，并通过其蛋白抑制靶卫星细胞中的肌细胞生成素表达，从而促进卫星细胞和成肌细胞增殖，加速损伤愈合[22]。Guescini 等[23]也证实，骨骼肌撕裂伤后自分泌富含肌原性生长因子的外泌体，诱导间充质干细胞向肌原性谱系分化以促进肌肉损伤修复。

3.2 外泌体miRNA 介导的骨骼肌损伤修复

miRNA 在骨骼肌损伤修复中的作用已得到广泛研究，由于外泌体携带丰富的miRNAs，越来越多的研究揭示了各种细胞来源的外泌体miRNAs 参与骨骼肌的再生修复。间充质干细胞源性外泌体内富集miR-125b、miR-494 和miR-601，研究发现，这些miRNAs 可作用于肌卫星细胞和成肌细胞，刺激其内生肌决定因子和肌细胞生成素的表达增加，调控其增殖和分化，同时还可以减弱肌纤维化，提高毛细血管密度，加速损伤肌肉的再生[24-25]。SCs 源性外泌体可转移其载荷的miR-1 至邻近的SCs，通过改变其成肌相关基因的表达促进SC 分化[14]。SCs 源性外泌体还可以通过激活成纤维细胞、沉积和降解ECM 以及补充组织细胞来重塑受损组织。超负荷诱导的肌肉损伤模型中SCs 源性外泌体通过转移其携带的miR-206 抑制邻近的成纤维细胞核糖体结合蛋白-1 表达，从而抑制胶原蛋白和纤连蛋白的生成，辅助受损肌肉再生和重塑[26]。成熟肌管以及成肌细胞源性外泌体中同样包含有多种与肌肉分化密切相关的miRNAs，如miR-133a和miR-133b，分别通过负调控成肌细胞中的Foxl2基因以及肌卫星细胞Pax7 基因的表达促进肌纤维再生[27-28]。骨骼肌去神经损伤后，肌肉衍生的外泌体从miR-720 转变为miR-206 富集状态，进而促进骨骼肌损伤修复[29]。此外，高强度骑车运动诱发的肌肉损伤中，肌肉衍生的外泌体miR-208a 参与调节肌纤维类型[30]。上述研究表明，在骨骼肌损伤疾病中，不同来源外泌体特定的miRNAs 在损伤背景下选择性装载和释放，参与肌纤维的再生和重塑。

3.3 外泌体其他内容物介导的骨骼肌损伤修复

外泌体内除miRNA 和蛋白之外还含有其他信息物质。Yan 等[31]发现间充质干细胞来源的外泌体可以改善小鼠缺血性肌肉损伤后的血液灌注和肌力及延长小鼠跑步距离，还能够抑制局部缺血所致的炎症小体引起细胞焦亡，进一步研究发现外泌体是通过其内环状RNA-circHIPK3 靶向肌细胞miR-421/FOXO3a，从而抑制细胞焦亡和白细胞介素-1 等炎症因子升高来修复骨骼肌缺血性损伤。Guescini 等[32]发现，体外培养的小鼠成肌细胞可以释放外泌体且其内携带线粒体DNA，并推测线粒体DNA 可通过外泌体途径进入靶细胞线粒体，向靶细胞传递信号进行调控，随后的研究也证实了猜想，高脂饮食喂养的小鼠的骨骼肌释放的外泌体能够诱导成肌细胞增殖并调节成肌细胞周期和分化相关基因的表达。此外，脂质组学分析也表明外泌体携带的脂质可在肌肉细胞之间转移，外泌体可以作为“类旁分泌”信号来调节肌肉动态平衡。

3 小结

外泌体是一种直径在30～150 nm 并携带多种信息物质的细胞外囊泡，其在骨骼肌损伤和修复过程中选择性装载内容物，因此探究骨骼肌损伤修复过程中外泌体的不同内容物，可以针对疾病发生的不同时间段进行优化治疗，大幅度改善患者的骨骼肌损伤情况。尽管外泌体在骨骼肌损伤性疾病临床治疗方面具有良好的应用前景，但是不同来源外泌体内复杂的信息物质类别、转运机制及作用机制等问题仍未明确，且对于外泌体量化生产及储存问题还面临一定的挑战，这些问题还需要进一步探讨。