Duchenne 型肌营养不良症治疗研究进展

史菲菲 刘红彦

郑州大学人民医院 河南大学人民医院 河南省人民医院医学遗传所，河南郑州 450003

Duchenne 型肌营养不良症（Duchennemusculardystrophy，DMD）是由DMD 基因突变引起的一种X 连锁隐性遗传病，在活产男婴中的发病率为1/3500[1]。DMD基因位于X 染色体上，包含79 个外显子，编码肌营养不良蛋白。DMD 患者的特点为进行性肌无力，多在3～5 岁前发病，由于肌肉功能持续退化，最终于20～30 岁死于呼吸或循环功能衰竭[2]。

肌营养不良蛋白在心肌和骨骼肌中表达，是抗肌营养不良糖蛋白复合物（dystrophin-glycoprotein complex，DGC）的重要组成部分。DGC 可以将肌动蛋白细胞骨架与肌肉纤维的细胞外基质连接起来，参与调节肌肉纤维的正常功能。当肌营养不良蛋白缺乏时，DGC 组装受损，肌膜的稳定性受到破坏，导致细胞内Ca2+浓度升高，从而激活钙依赖蛋白酶，进一步引起炎症和纤维化的积累，最终导致肌肉功能不断退化[2]。

随着对DMD 发病机制的研究不断深入，各种治疗方法层出不穷，如糖皮质激素、外显子跳跃、无义突变通读治疗、Myostatin 抑制剂、上调Utrophin、CRISPR/Cas9 等，本文将对上述治疗方法进行综述。

1 糖皮质激素

糖皮质激素是目前唯一被循证医学证实有效的药物。它可以刺激成肌细胞增殖，抑制肌肉蛋白分解，进而改善肌肉的功能和力量[3]。与未经治疗的患者比较，糖皮质激素的使用可使患者行走能力平均延长2～5 年[4]。目前指南[5]推荐的最佳剂量为泼尼松0.75 mg/（kg·d）或地夫可特0.9 mg/（kg·d）。但激素的各种不良反应，如体重增加、骨质疏松、肥胖、多毛等限制了其长期应用。Vamorolone（VBP15）是一种新型类固醇，与糖皮质激素作用相同，但副作用却明显减少。最近一项纳入48 例患儿采用Vamorolone治疗24 周的研究结果显示[6]，肌肉炎症反应明显减少，同时无严重不良反应的发生。

2 外显子跳跃治疗

DMD 外显子跳跃治疗的原理是基于阅读框规则，即如果阅读框发生移码突变，则不能产生功能性肌营养不良蛋白，导致表型严重的DMD；如果发生整码突变，可产生具有部分功能的肌营养不良蛋白，造成表型较轻的Becker 型肌营养不良症（Becker muscular dystrophy，BMD）[1]外显子跳跃治疗通过反义寡核苷酸选择性剪接pre-mRNA，引起相应外显子跳跃，使阅读框得以恢复，产生截短但仍有部分功能的肌营养不良蛋白，从而使DMD 转变为BMD[7]。

Drisapersen 是一种2-O-甲基磷硫酰反义寡核苷酸，可促进51 号外显子跳跃。有研究表明[8]该药可以改善DMD 患者6 min 步行试验距离（6 minute walking test，6MWT），但一项Ⅲ期临床试验研究发现[9]6MWT 的改善无统计学意义，因此美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）拒绝批准Drisapersen上市。

Eteplirsen 是一种磷酸二胺吗啉低聚物，促进51 号外显子跳跃。一项研究表明[10]，服用Eteplirsen 治疗3 年后DMD 患者的6MWT 下降速度比安慰剂组慢。在另一项为期48 周的Eteplirsen 治疗中[11]，DMD 患者的肌营养不良蛋白含量从0.16%增加到0.44%，且安全性好，据此Eteplirsen 有条件地获得了FDA 的批准。

Golodirsen 用于外显子53 的跳跃治疗，一项纳入25 例DMD 患者的为期168 周的Ⅱ期临床试验表明[12]，该药可使DMD 患者肌营养不良蛋白含量从0.095%增加到1.109%，差异有统计学意义。2019 年12 月，Golodirsen 获得FDA 批准上市[13]。

Viltolarsen 是一种磷酸二酰吗啉反义寡核苷酸，可促进53 号外显子跳跃。在一项纳入16 例患者为期20 周的Ⅱ期临床试验中[14]，治疗组产生的肌营养不良蛋白含量明显增加。Viltolarsen 于2020 年相继在日本和美国获得批准上市[15]。

3 无义突变通读治疗

无义突变可导致mRNA 提前出现终止密码子，从而使翻译终止。无义突变通读疗法利用小分子与核糖体结合，跳过提前出现的终止密码子，可继续产生有功能的肌营养不良蛋白[16]。庆大霉素可以与核糖体结合，从而发挥无义突变通读的作用。一项动物研究中[17]，MDX 小鼠（外显子23 存在无义突变）给予庆大霉素治疗后，肌营养不良蛋白表达大约恢复到正常水平的20%。然而小鼠试验结果与人体试验不一致，一项人体试验并没有检测到肌营养不良蛋白表达的增加[16]。

为了克服抗生素类药物的副作用及通读能力差等缺点，PTC Treateutics 发现了一种名为Ataluren 的分子，它能够诱导终止密码子通读[18]。一项为期48 周的Ⅱa 期临床试验表明[19]，Ataluren 总体上安全性良好，可以显著延缓无义突变DMD 患者的疾病进展。然而2018 年的一项3 期临床试验表明[20]，Ataluren 和安慰剂对照组患者的6MWT 比较无显著差异。

4 基因替代

基因替代是将外源性正常基因导入DMD 患者体内，从而表达正常遗传物质。1990 年英国报道了1 例61 岁仍具有行走能力的DMD 患者[21]，这表明即使有较大的DMD 基因缺失，表型也可能非常轻微。因此，具备功能但内部结构缺失的mini-dystrophin 和microdystrophin 为基因替代治疗创造了机会。

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是基因替代治疗最常用的载体，它具备高效转染心肌细胞与骨骼肌细胞的能力。一项DMD 犬模型试验表明[22]，AAV micro-dystrophin 治疗可以使肌营养不良蛋白在肌肉中持续、稳定的表达，增强实验动物的肌肉力量。

5 上调Utrophin

Utrophin 是肌营养不良蛋白结构和功能的类似物，表达于发育中肌肉的肌膜上。动物实验表明[23]，双dystrophin-Utrophin 基因敲除小鼠比dystrophin 基因突变的MDX 小鼠表现出更严重的肌肉无力和心脏异常，预期寿命更短。SMTC1100/Ezutromid 是一种新型口服Utrophin 小分子刺激物，1b 期临床试验结果较为理想[24]，明显提高了肌营养不良蛋白的表达水平。

6 离子的调节

在营养不良的肌肉中，Ca2+浓度失衡是一个重要的致病环节。因此，调节细胞内Ca2+含量可以增强肌肉的功能。ARM210 是一种兰尼碱受体（ryanodine receptors，RyR）通道稳定剂，可以防止骨骼肌、心肌的Ca2+渗漏，其改善肌肉力量的作用在动物实验中得到证实[25]。

7 Myostatin 抑制剂

Myostatin 是一种肌肉生长的负向调控因子，通过抑制Myostatin 可以使肌肉明显增生和肥大。在MDX小鼠中，Myostatin 的丢失降低了肌营养不良的严重程度[26]。组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂能降低Myostatin 的表达水平，Givinostat 是一种HDAC 抑制剂，一项纳入20 例DMD 患儿的研究显示[27]，Givinostat 治疗后，患儿活检组织中肌肉组织的比例和纤维组织的数量显著增加。

8 基因编辑

2013 年人类发现了一种强大的基因编辑工具：成簇规则间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关的核酸酶[28]。Cas9 核酸内切酶可以在sgRNA 上靶向编辑，使DNA 双链裂解，随后通过非同源末端连接使外显子跳越；而同源定向修复可以用正确的序列替换DMD 突变并产生正常的肌营养不良蛋白。Long 等[29]通过基因编辑纠正了MDX 小鼠生殖细胞外显子23 的无义突变，最终80%MDX 小鼠的肌肉功能得到改善。另一项50 号外显子缺失的实验鼠，通过基因编辑实现了51 号外显子的跳跃，也取得了良好的治疗效果[30]。

随着对DMD 发病机制研究的深入，各种新兴治疗方法也不断出现，为疾病的治疗提供了更广阔的思路。但我们也应清楚地认识到DMD 治疗面临着诸多挑战。临床医师仍需把目前的工作重心放在携带者筛查及产前诊断上，从根本上阻断DMD 突变基因的传递。