间充质干细胞外泌体在针刺治疗缺血缺氧性脑病中的作用研究进展

季一峰，鲍超，李彦彩，陈栋

(南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029)

缺血缺氧性脑病(Hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)是脑组织缺血缺氧引起的脑部病变，其中新生儿HIE最为常见[1]。HIE分为轻、中、重三种程度，临床表现上，轻度常出现兴奋症状，中度以抑制症状为主，重度则可至昏迷。研究表明[2]，我国HIE发病率可达活产新生儿的3‰～6‰，其中死亡于新生儿期的患儿约占15%～20%。存活的患儿亦有20%～30%留下神经系统损伤，如脑瘫、癫痫、智力障碍、感觉障碍或学习障碍[3-4]，给本人、家庭与社会都造成沉重的负担。

HIE至今尚无完整统一的治疗方案，治疗上主要以纠正缺血缺氧为主。亚低温治疗是目前公认治疗新生儿脑病有效的疗法，但是其安全性仍未明确[5]，甚至存在着硬肿及弥散性血管内凝血的风险[6]。针刺治疗HIE已被证实确有疗效[7]，然而，其作用机制仍需进一步研究。目前许多研究证实，间充质干细胞外泌体(mesenchymal stem cell exosomes，MSC-Exo)能够减少神经元细胞凋亡，促进神经功能恢复，达到脑保护作用[8]。基于此，本文分析了MSC-Exo及其介导的细胞凋亡与HIE的关系，探讨了MSC-Exo在针刺治疗HIE中的可能作用。

1 细胞凋亡与HIE的相关性

1.1 细胞凋亡是导致HIE的重要因素

HIE的病因是由各种原因所致的脑组织缺血缺氧，其中围产期窒息是最主要的原因[9]。HIE的发病机制尚未明晰，一般认为可能与炎症反应、细胞凋亡、免疫功能改变有关[10]，最终引起脑水肿、神经胶质增生、神经元坏死等脑组织病理性损害[11]。其中，细胞凋亡在HIE的发生发展中起着重要作用。

细胞凋亡，是细胞为了保持内环境稳态，在基因调控下有序、自主地死亡。细胞凋亡对机体的生长发育有着重要的作用[12]。细胞内外的各种病理因素，都可能导致细胞凋亡的发生。

1.2 缺血缺氧下细胞凋亡的发生机制

缺血缺氧环境下，脑组织血流量下降，供氧不足，会增快神经元细胞能量消耗，加剧兴奋性毒性与氧化应激反应。氧化应激加剧则会引起线粒体功能衰退，进一步增快神经元细胞的能量消耗，导致神经元细胞损伤乃至凋亡。氧化应激加剧还会使线粒体膜内外离子通透性增加，使线粒体跨膜电位改变，从而引起钙离子超载，增加细胞负荷，导致细胞损伤与凋亡。此外，细胞凋亡又会反过来进一步加剧氧化应激，造成恶性循环，加重缺血缺氧的进展，对脑组织造成持续性损伤[13-14]。

因此，通过干预减少细胞凋亡的发生与进展，是治疗HIE的一条关键途径。

2 MSC分泌抗细胞凋亡的外泌体，治疗HIE

2.1 MSC分泌携带miRNAs的外泌体

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一种多能干细胞，有着自我更新与多向分化的能力，是目前生命科学的新热点。MSC能够分泌细胞外囊泡，将生物活性分子输送至靶细胞，从而修复受损组织[15]。细胞外囊泡分为外泌体、凋亡小体和微泡，研究最为广泛的是外泌体。外泌体是一类直径在40～100 nm的脂质囊泡[16]，其内容物中包裹各种脂质、蛋白质和RNAs[17]，通过将这些物质靶向释放，从而实现细胞间物质传递的作用。诸多研究证明，外泌体能够减轻缺血缺氧下的细胞损伤与凋亡[18-20]，这可能与外泌体内容物中的miRNAs有关。

2.2 miRNAs调控细胞凋亡

miRNAs是一类由核苷酸构成的非编码单链RNA分子，在细胞增长、分化以及凋亡等方面发挥巨大作用[21]。越来越多研究证明，miRNAs能够通过调控细胞凋亡，从而干预HIE。XIAO Q X等人[22]发现，缺血缺氧性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)大鼠的miR-410-3p水平明显低于正常大鼠。在上调miR-410-3p水平后，HIBD大鼠的神经元凋亡指数降低，神经元存活数量增加，运动与认知能力也有所提升。YANG G等人[23]发现，在HIE模型中miR-146b-5p的过表达能减轻细胞凋亡与炎症反应，而抑制miR-146b-5p则具有相反的作用。miR-21亦是一个重要的抗凋亡miRNA，能够负向调节PTEN水平，激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，从而抑制细胞凋亡，改善脑损伤[24-25]。

由此可见，MSC来源的miRNAs能靶向作用于神经元细胞，介导神经元细胞凋亡，达到脑保护作用。

2.3 MSC的临床运用现状与问题

综上，越来越多的人们开始考虑运用MSC治疗HIE。MSC移植是目前临床上的一种前沿疗法。DING H等人[26]将胎盘来源的MSC移植入HIBD模型大鼠后，发现抗炎因子白细胞介素-10水平增加，炎性反应减轻，提示MSC可能通过释放抗炎因子从而改善脑损伤。JOERGER-MESSERLI M S等人[27]发现，MSC移植能够减轻围产期HIE小鼠的神经元细胞凋亡，而这种作用似乎是由MSC分泌的let-7-5p调控所致的。

虽然MSC在抗凋亡方面有效，但在临床实践中也存在着一定的局限性。一方面，目前MSC在体外实验中出现细胞存活率较低，移植难度较大，价格相对较贵等问题，制约着现阶段临床推广运用使用。另一方面，对于MSC移植治疗，我国尚未形成统一的标准化规程，在安全性、有效性及稳定性方面仍需进一步完善。因此，如何更有效、更低廉、更规范化地将MSC运用于HIE的治疗中，是当前亟需解决的一个难题。

3 针刺调控MSC治疗HIE的可能机制

3.1 中医学对HIE的认识

HIE在中医学中无明确病名，依照临床表现，可归为“五迟”“五软”“胎弱”“胎怯”范畴。本病病位在脑，其基本病机是脑髓不充，肢体失用。病因方面，则可归为先天禀赋不足或是后天调养失当[28]。一方面，父母精血不足，或母亲孕期中疾病缠身，或早产者，致患儿先天禀赋不足，致使精血不足，脑髓不充，筋骨肌肉、四肢百骸皆失所养。正如《医宗金鉴·幼科心法要诀》所云：“小儿五迟之症，多因父母气血虚弱，先天有亏”。另一方面，亦有后天感受邪毒，或难产、产伤，或脐绕颈等者，损伤脑络，以致脑髓不充，导致四肢百骸、筋骨肌肉失养，发为本病。《诚书·论行迟》云：“又有离胎多病，与饮病乳，或过食肥甘，则疳症所侵，血气日惫，十有六七”。因此治疗上，当立足病因病机，以健脑生髓为根本大法。

3.2 针刺治疗HIE机制仍需探究

针刺疗法在治疗HIE方面已被临床证实确有疗效，前景十分广阔。《素问·骨空论》云：“督脉者……贯脊属肾……与太阳起于目内眦，上额交巅，上入络脑”。督脉是“阳脉之海”，总督一身之阳，又贯脊背而入脑。与足太阳膀胱经相交，有着温阳行气，补脑生髓之效，故许多医家都非常注重督脉的运用。此外，《素问·阴阳应象大论》认为“肾生骨髓”，因此在治疗上亦当注重补肾生髓。赵梁育[29]等通过针刺督脉、任脉、膀胱经诸穴，并联合丹参注射液治疗HIE，有效率达89.47%，治疗后患儿血流变、新生儿神经行为评分表(NBNA)均有显著提高。张生玉[30]等采用“醒脑开窍”针法，针刺“四神聪”“百会”“水沟”“风池”“内关”“太冲”等穴，并结合高压氧治疗HIE，发现患儿血流变、认知功能与日常生活行为能力均优于单纯高压氧治疗。

虽然目前很多研究证明了针刺对于治疗HIE有效，但是作用机制尚有争议。目前关于针刺治疗HIE作用机制的研究是多方面的，涉及脑血流量、病理形态学、能量代谢、自由基代谢、细胞凋亡、突触联系、神经营养因子表达等，但许多机制仍需要进一步的探索。

3.3 针刺调控miRNAs抑制细胞凋亡

越来越多的研究证明，针刺能够调控miRNAs水平，介导细胞凋亡从而产生神经保护作用。ZHOU H[31]等人用电针(Electro-acupunture，EA)刺激大脑中动脉缺血(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠，发现EA能够抑制miR-191a-5p的表达，减少细胞凋亡，从而保护脑组织。SHA R[32]等人发现EA刺激MCAO模型大鼠后，大鼠miR-223的水平升高，细胞凋亡指数降低，这说明EA可能通过调控miR-223水平减少细胞凋亡，从而治疗脑损伤。 ZHANG S[33]等人发现EA可以上调miR-146b的表达，减少细胞凋亡，并促进神经干细胞分化，从而改善MCAO大鼠的神经损伤。

由此可见，miRNAs介导的细胞凋亡可能是针刺治疗HIE的作用机制，但起作用的miRNAs的来源仍需进一步探究。

3.4 针刺调控MSC水平

MSC-Exo能够定向迁移至靶细胞，实现细胞间的物质传递，从而治疗疾病。这与中医学中的经络相类似。经络“沟通表里，联系脏腑”，又“运行气血，调和阴阳”，亦是一个进行物质传递，从而治疗疾病的通道。因此，MSC-Exo很有可能是经络的科学内涵之一。中医学认为，针刺会通过经络产生治疗作用。从分子生物学角度上来看，很可能是针刺作用于MSC，通过MSC-Exo将携带的miRNAs释放于靶细胞，从而产生治疗作用。

如果受到针刺调控的miRNAs来源于MSC，那么针刺应当对MSC产生作用。最新研究表明，针刺确实能够调节机体内MSC的水平。

LIU L[34]等人用电针(EA)刺激大鼠“脊中”“命门”穴位，发现外周血中的MSC水平显著增高，由此提出，EA刺激能够促进骨髓MSC进入外周血循环。SALAZAR T E[35]等人则通过实验进一步明确作用机理。研究指出，在经过EA刺激后，大鼠外周血内的MSC水平明显高于刺激前，这可能是由于EA使得大鼠下丘脑内以及下丘脑与杏仁核等邻近脑区之间的功能连接强度增加，从而激活交感神经系统(SNS)所致，激活的SNS促进MSC释放到外周血循环中，增加循环MSC水平并转运到受损组织，从而辅助组织修复。

由此可见，在针刺作用下，MSC的水平提高。MSC水平提高则会产生更多的MSC-Exo作用于靶细胞，使得miRNAs表达增加，从而抑制细胞凋亡，形成脑保护作用。这可能是针刺治疗HIE的分子生物学机制之一。

4 小结

目前，关于针刺通过调节MSC-Exo从而治疗HIE的研究鲜有报道。但是目前已经应用于临床的MSC移植治疗方案，证明了MSC-Exo携带着miRNAs等物质，通过多种通路靶向作用于神经元细胞，从而介导神经元细胞凋亡，达到脑保护作用。而最新研究表明，针刺能够调控miRNAs介导细胞凋亡，亦能调节机体内的MSC。基于此，笔者推测针刺能够通过对自体MSC的调节，促进MSC-Exo源性miRNAs的释放于靶细胞，从而减轻细胞凋亡，达到治疗HIE的效果。在今后的研究中，深入探究MSC、MSC-Exo以及miRNAs在治疗HIE中的作用，能够为针刺治疗HIE提供科学客观的作用机制，带来新的研究思路与研究途径，从而更好地服务于临床。