替莫唑胺对脊髓胶质瘤的疗效及对MGMT、Survivin和caspase-3的影响

胡国良，李全春，朱 强，衣志刚，张远征

(延安大学附属医院神经外科，陕西延安716000)

脊髓胶质瘤患者由于椎管空间狭小，导致肿瘤细胞对脊髓、神经根产生挤压，造成神经损伤，神经外科医师的一个棘手问题[1]。目前电生理监测下显微手术切除为主要治疗手段，显微常规切除技术配合使用神经电生理监测，可有效实施监测神经损伤情况，明晰切除范围，提高切除率，降低副损伤，减少复发率[2]，研究显示替莫唑胺是神经系统胶质瘤的一线烷化剂类药物，具有口服吸收快、耐受性好、血脑屏障通透性高以及不良反应轻微等特点[1，3]，因此本文将通过实例进一步观察神经电生理监测下显微外科切除术联合替莫唑胺对脊髓胶质瘤的疗效。由于Survivin基因、caspase-3活性、MGMT基因分别作用于肿瘤的生长、增殖、转移以及耐受过程，其中Survivin基因可表达凋亡抑制蛋白，可有效抑制肿瘤细胞凋亡，Caspase-3可降低细胞穿透力，促进细胞凋亡，MGMT作为DNA修复基因，可修复肿瘤细胞因药物毒性引起的DNA损伤，三者水平变化可反映疾病进展[4]，通过检测两种基因表达情况和caspase-3活性，研究替莫唑胺治疗脊髓胶质瘤的机制，现报道如下。

1 临床资料

1.1 基本资料

选取延安大学附属医院于2015年1月至2019年5月收治的80例脊髓胶质瘤患者，依据随机数字表法分为观察和对照两组，每组40例，年龄23～60岁，男50例，女30例。两组患者入组前的基线资料(见表1)具有可比性。所有患者均签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①术前MRI影像学资料完整，且经过病理学确诊为脊髓胶质瘤，神经系统临床症状和体征明确；②白细胞≥4.0×109/L，血小板≥100×109/L，血红蛋白≥100 g/L。排除标准：①心、肾、肝等重要脏器功能障碍或造血系统疾病者，精神类疾病患者，其他原因引起的脊髓炎；②术后均未进行放疗和化疗；③药物不耐受，依从性较差，手术禁忌症。

表1 基线资料比较

1.3 方法

1.3.1 手术治疗 两组患者手术切除过程均采用神经电生理监测(厂家：美国尼高力)监测患者肌电图(EMG)、运动诱发电位(MEP)以及躯体感觉诱发电位(SEP)，术中上下肢参考电极均置于前额FPz位置，频率2～5 Hz，连续刺激8个/次，强度15～40 mA/个，手术过程中振幅变化幅度超过50%则表明达到报警标限度。EMG监测时参考电极放于肌腱，记录电极置于手术操作过程中神经支配的肌肉即可。

两组患者取全麻俯卧位，C臂下定位暴露、切除椎板，于显微镜下切开硬膜，依次从脊髓肿瘤顶端的中线部位纵向切开蛛网膜、软脊膜、脊髓，直至露出肿瘤。如果肿瘤与周边正常组织分界明显，则沿着界限剪开并切除；若边界模糊，则保守切除，在确认的肿瘤范围内尽可能大部分切除，在实际切除过程中参考EMG、MEP、SEP变化幅度进行切除，一旦达到警告标准，则应立即停止切除，找出原因待波幅恢复后继续手术。切除肿瘤后伤口处用温盐水冲洗，用小功率双极电凝进行烧灼止血，止血彻底后逐层缝合手术。

1.3.2 术后分组治疗 两组患者术后一周内行MR检查评估肿瘤切除情况，所有患者通过定期或不定期门诊复查、随访12个月，观察有无复发率以及死亡情况。观察组术后一周开始给予替莫唑胺(厂家：江苏天士力公司；规格：50 mg/粒；批号：20150601)，起始给药剂量按体表面积(150 mg/m2)给药，1次/d，5次/w，从第2周期开始给药剂量按200 mg/m2计算，共治疗3个月，并随访12个月。对照组给予定期复查，不进行相关肿瘤干预治疗。

1.3.3 细胞实验 患者脊髓胶质瘤被切除后，生理盐水中清洗后，于显微镜下除去坏死组织，剩余部分保存于液氮罐，备用。

原代肿瘤细胞培养：用无血清RPMI-1640培养液(含链霉素、青霉素)清洗肿瘤组织标本3～5次，无菌眼科剪剪碎肿瘤组织(约为1 mm3)，吸管反复吹、不锈钢网研磨过滤，最终得到单个细胞悬液，1000转/min(半径13.5 cm)条件下离心10 min，除去上清液，加入无血清RPMI-1640培养液清洗3次即可，最终调整培养液体积，并培养24 h，保证细胞悬液的活细胞计数为4×105个/mL。

采用Transwell小室法分析替莫唑胺对原代肿瘤细胞转移能力的影响：在Transwell小室涂细胞外基质胶，待干燥后加入细胞培养基(含20%无血清RPMI-1640培养液)，并在小室下侧加入20%无血清RPMI-1640培养液。随后于上侧加入0.1 mL细胞悬液(包含终浓度分别为0、5、10、20、50、100 μmol/L的替莫唑胺)，温孵16 h，于设定时间取出小室，多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色30 min，PBS溶液冲洗滤膜并去除上室细胞，显微镜下观察拍照，在200倍镜下随机选择5个视野观察，计算穿膜细胞数，其中细胞的侵袭能力表示为穿膜细胞数与未经过替莫唑胺处理的穿膜细胞数的比值，平行操作三次。

细胞凋亡蛋白Caspase-3活性检测：0.1 mL细胞悬液(包含终浓度分别为0、5、10、20、50、100 μmol/L的替莫唑胺)接种于96孔不透明白板，温孵育24 h后取出96孔板，平衡至室温，每孔加入0.1mLCaspase-Glo®3/7试剂，混匀后温孵育60 min，采用酶标仪检测405 nm处吸光度(OD)值即可。

免疫细胞化学染色法检测Survivin、MGMT蛋白表达情况：0.1 mL细胞悬液(包含终浓度分别为0、100 μmol/L的替莫唑胺)接种于96孔板中，温孵育24 h后取出96孔板。重悬处理，取细胞重悬液滴到载玻片上，对拉两张玻片使得细胞均匀涂抹，稍干后放于固定液(4%甲醛溶液)中固定15 min。然后用刀片将沉淀物刮下，纱布包裹放入包埋盒，脱水制片，抗原修复、一抗孵育、二抗结合、DAB显色、苏木素复染、脱水、封片等过程。其中兔抗人Survivin多克隆抗体(型号SC-10811)购自于Santa Cruz Biochemology公司，鼠抗人MGMT单多克隆抗体购自于上海优宁维生物科技有限公司。Survivin、MGMT染色评判：以胞核、质内显示棕色颗粒则为阳性，并根据染色强度、阳性细胞比例进行分级。其中染色强分为0分(无色)、1分(浅黄色)、2分(棕黄色)、3分(棕褐色)；阳性细胞率：随机选择10个高倍视野(200)，1000个细胞/视野，0分(无阳性细胞)、1分(阳性细胞率小于10%)、2分(阳性细胞率在11%～50%范围内)、3分(阳性细胞率在51%～75%范围内)，4分(阳性细胞率超过75%)。两项乘积为0分(-)，1～2分(+)，3～6分(++)，8～12分(+++)，其中3分以上则为阳性[5]。

1.4 临床治疗评价

肿瘤切除率：记录手术的全切、次切以及部分切除例数。所有患者通过定期或不定期门诊复查、电话随访12个月，并统计随访1年的复发率以及1年死亡情况。

术前以及术后3个月评估患者Mc Cormick神经功能分级[6]：分为四个级别，其中I级表明神经功能正常，或者轻微损伤但不影响正常肢体运动功能，Ⅱ级表明神经功能中度损伤，步态、反射中度异常，疼痛严重，生活质量降低，但可自理，Ⅲ级表明神经功能重度损伤，双上肢丧失功能，行走需扶助，生活不能自理，Ⅳ级表明神经功能极为严重损伤，双上肢完全丧失功能，需要借助轮椅生活，生活完全不能自理。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 临床治疗疗效

2.1.1 肿瘤切除率、复发率、死亡率 两组全切率、次切率、部分切除率差异无统计学意义，采用替莫唑胺治疗后观察组患者复发率显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，随访一年观察组患者死亡率为5.00%(2例)，显著低于对照组22.50%(9例)，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表2 肿瘤切除率、复发率、死亡率[%/(n)]

2.1.2 McCormick神经功能 治疗3个月后，两组患者的McCormick神经功能差异无统计学意义(P<0.05，见表3)。

表3 McCormick神经功能[%(n)]

2.2 细胞实验结果

2.2.1 脊髓胶质瘤细胞转移能力以及Caspase-3活性 随着替莫唑胺浓度的增加，细胞侵袭能力不断下降，且显著低于空白对照组(P<0.05，见表4)。随着替莫唑胺浓度的增加，脊髓胶质瘤细胞凋亡蛋白Caspase 3活性不断增加(见图1)。

2.2.2 Survivin、MGMT基因表达情况 经过替莫唑胺干预培养后，免疫组化验检查发现替莫唑胺组Survivin表达阳性率显著低于空白对照组(P<0.05)，MGMT基因表达阳性率略低于空白对照组，差异无统计学意义(P>0.05，见表5、表6)。

表4 脊髓胶质瘤细胞转移能力

表6 MGMT基因表达情况

3 讨论

脊髓胶质瘤作为临床少见的恶性肿瘤，具有局部扩散容易、预后效果较差等特点，可发生于脊髓任一节段，但颈、胸部较为常见，主要分为星形细胞瘤、室管膜瘤两种类型[2，7]。脊髓胶质瘤临床发病率较低，且发病前期无特异性症状，导致早期难以准确检测、诊断，且发病部位的特殊性，容易被误诊为颈椎病、腰椎病等骨性疾病，或者神经炎、多发性硬化症、脱髓鞘性病变等神经性疾病[8]，一旦确诊往往已进展至III～IV期，延缓了治疗的及时性，增加治疗难度。随着医学科学的进步，不同学科间的融合，对于脊髓胶质瘤的治疗逐步形成完整的治疗体系，目前手术切除是首选方案，配合影像学、神经电生理学等检测手段，结合放化疗方案大大提高治疗效果。

本次研究结果显示，两组患者全切率高达85%，表明神经电生理监测下显微外科切除术可显著提高脊髓胶质瘤的手术切除效率，与张功义，等[2]报道相近，即神经电生理监测辅助显微手术即能有效提高肿瘤全切率，保护脊髓神经功能。术前、术中定位对于脊髓胶质瘤的手术切除至关重要，采用MRI对脊髓胶质瘤进行定位，可清晰显现肿瘤生长情况，如室管膜瘤平扫多呈现节段性脊髓增粗，头尾端常呈现囊变、空洞等，一旦肿瘤与脊髓界面不清，则立即停止切除。指导切除方向时刻沿着肿瘤与脊髓界线方向延伸，实际切除过程中进一步参考EMG、MEP、SEP变化幅度，一旦达到警告标准则立即停止切除，从而保证在不损伤神经功能前提下最大限度切除肿瘤，特别是与神经紧紧连接的肿瘤组织，提高肿瘤全切率[2]。经治疗后两组患者McCormick神经功能I级约为80%，表明神经电生理监测下显微外科切除术可有效降低神经功能损伤，促进预后。分析认为神经电生理监测可对上、下行传导通路进行完整评估，其中SEP可有效反映脊髓后索状态，MEP则是直接反映患者皮质脊髓束状态，EMG可准确评估支配肌肉神经根的瞬时状态，三种检测模式同步进行，从而指导医师准确判断切除安全区域，降低手术切除风险[2，9]。

同时，经治疗后发现观察组患者术后复发率显著低于对照组，表明神经电生理监测下显微外科切除术联合替莫唑胺可显著降低复发风险，与郭超[1]等人报道一致。分析认为术后配合使用替莫唑胺，其可通过血脑屏障，通过烷基化DNA分子上鸟嘌呤第6位O原子上和第7位N原子，损伤肿瘤细胞DNA，发挥细胞毒作用，从而进一步杀死未切除的肿瘤细胞，降低复发风险[3]。通过体外细胞实验研究进一步证实，替莫唑胺可增加降低脊髓胶质瘤细胞的侵袭能力，增加凋亡蛋白Caspase3活性，其中Caspase-3活性增加可促进细胞凋亡，降低细胞穿透力，最终提高替莫唑胺抗肿瘤效率，降低转移复发风险[4]。替莫唑胺还可抑制Survivin基因的表达，Survivin基因表达产物为凋亡抑制蛋白，可有效抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞的增殖分化[10]，故而观察组患者治疗效果明显优于对照组，死亡率、复发率明显低于对照组。MGMT作为DNA修复基因，可修复被替莫唑胺烷基化的肿瘤DNA[3，11]，故而本次实验中替莫唑胺对其抑制效率不显著。因此，在实际临床治疗过程中，部分患者会对替莫唑胺的敏感性逐渐降低，则需配合使用顺铂，可有效抑制肿瘤细胞中MGMT蛋白的转录过程，从而抑制MGMT表达，增强替莫唑胺作用，进一步杀死肿瘤细胞，故而降低肿瘤复发率，有利于预后。

综上所述，替莫唑胺可增加神经电生理监测下显微外科切除术对脊髓胶质瘤的治疗效果，其机制可能与增加caspase-3活性和抑制Survivin基因表达有关，从而降低术后复发率和死亡率。