Behcet病的表观遗传学研究进展

郑光柄，王 欣，于红松

(遵义医科大学 基础医学院贵州省眼疾病特色重点实验室，贵州 遵义 563099)

Behcet病(Behcet's disease,BD)为炎症性疾病，以反复发作的口腔溃疡、生殖器溃疡、葡萄膜炎和皮肤损伤为主要临床表现，并可累及关节、消化系统、神经系统等[1-2]。该病好发于地中海沿岸、远东及中东地区，因其分布与古丝绸之路相吻合，故又称丝绸之路病(Silk road disease)[3]。迄今为止，BD的发病机制尚不明确，据报道，HLA-B51是与BD相关性最强的易感基因，但所占风险不到20%[4]。近期研究表明，遗传、表观遗传、免疫及环境因素与BD的发生与发展密切相关[5-6]，尤其是环境因素引起的表观遗传修饰改变在BD的发病机制中起着重要的作用。

表观遗传学研究可遗传的基因表达变化，而这些变化并不涉及DNA序列的改变[7]，因而表观遗传变化具有可逆性，这种可逆性与可控性已证实可被诸如特殊饮食、药物及生活环境改变等方法予以纠正和逆转[8-9]。近年来大量研究表明表观遗传修饰的改变在人类疾病的发生过程中发挥重要的作用[10-12]。DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA是表观遗传的三大主要调控机制，其作用是调控基因的表达和参与细胞的发育、分化以及活性的维持[13]。本文就表观遗传学因素(DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA)在BD发病机制中的研究进展作一综述。

1 DNA甲基化与BD

DNA甲基化是指DNA序列上特定的碱基在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)作为甲基供体，通过共价键结合的方式获得一个甲基基团的化学过程[14]。DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子上，其产物为5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)，DNA甲基化不改变DNA的序列，但可通过改变DNA与蛋白质的相互作用，从而影响基因转录活性[15]。DNA甲基化是人类基因组中一种常见的修饰方式，在CpG二核苷酸中的发生率为70%～80%。CpG岛与启动子相关的异常DNA甲基化可导致基因表达缺失，而基因表达降低是基因失活的一种关键机制[16]。通常情况下，启动子区域DNA甲基化程度与基因表达水平呈负相关，高甲基化抑制基因表达，低甲基化则促进基因表达[17]。

近期研究表明，全基因组水平的DNA甲基化异常参与了BD的发生。Yu等[18]采用Infinium Human Methylation 450K芯片技术分析方法，对60个BD患者和60个正常对照外周血液样本开展了全表观基因组关联研究(Epigenome-wide association studies,EWAS)，鉴定了与BD相关联的4332个差异DNA甲基化位点，其中547个位点在BD中呈现高甲基化，3785个位点在BD中呈现低甲基化，其中Delta-β≥0.14的位点共5个，包括FKBP5/cg03546163、FKBP5/cg25114611、NFIL3/ cg142905 76、RUNX2/cg23261343和FLJ43663/ cg20228731；课题组进一步采用焦磷酸测序的方法在100例BD患者和100个正常对照者中验证候选的5个差异的甲基化位点，结果证实了候选的5个差异的甲基化位点与BD显著相关，均在BD中呈现低甲基化，其中P值最小的位点为FKBP5/cg03546163(P=3.81E-13)；利用100例BD患者和100个正常对照的焦磷酸测序结果进行BD生物学标记筛选，结果表明，其中4个差异的甲基化位点(cg03546163,cg25114611,cg23261343 and cg14290576)可以作为BD疾病诊断的生物标记物(AUC=83.95%)；课题组还初步探索了异常DNA甲基化的功能：其中BD患者中低甲基化的FKBP5基因和FLJ43663基因，相对于正常对照，mRNA表达水平显著升高；相对于未用DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(DAC)处理培养的外周血单个核细胞(PBMC)组，DAC处理的PBMC组中FKBP5基因和FLJ43663基因的mRNA表达水平显著升高，DAC处理的PBMC组中IL-1β的分泌显著增加；以上研究结果均揭示了DNA甲基化异常在BD发病机制中起着非常重要的作用。Hughes[19]应用Infinium Human Methylation 450K芯片技术，对土耳其16例年龄、性别和种族相匹配且未经治疗的BD患者和16个健康对照进行研究，评估了单核细胞和CD4+T细胞中485000个甲基化位点在全基因组中的甲基化状态，结果发现，与正常对照相比，BD患者单核细胞中有383个CpG差异表达的甲基化位点，包括129个高甲基化CpG位点和254个低甲基化CpG位点；在BD患者CD4+T细胞中发现了125个CpG差异甲基化位点，其中67个低甲基化位点和58个高甲基化位点；进一步研究发现，BD患者接受治疗后CD4+T细胞及单核细胞的差异甲基化位点发生了逆转，检测到单核细胞共有1426个差异甲基化的CpG位点；其中790个为高甲基化，636个为低甲基化。在CD4+T细胞中，共有2044个CpG位点在治疗后发生差异性甲基化，其中1032个位点出现高甲基化，1012个位点发生低甲基化；研究者还通过生物信息学分析发现调节细胞骨架动力学的基因在两组之间存在异常的DNA甲基化，揭示调控蛋白的多种细胞骨架结构基因的异常DNA甲基化与BD的发病机制密切相关，是BD的发病机制及其治疗的基础。

除了全基因组水平鉴定BD异常甲基化的研究外，最近也有多项研究发现单个CpG位点的 DNA 甲基化异常也参与了BD的发生。Ali等[20]分析了伊朗51例 BD 患者和63个健康对照组的白介素10(Interleukine-10,IL-10)基因启动子区域的甲基化水平以及IL-10基因mRNA及蛋白质表达水平，结果表明，与对照组相比，BD患者组中IL-10基因mRNA表达水平显著降低，血清中IL-10水平也显著降低，且BD患者组IL-10基因 mRNA表达水平和血清中IL-10分泌水平均与IL-10基因启动子的甲基化程度呈负相关；IL-10是一种免疫调节细胞因子，研究发现IL-10的表达缺失与许多自身免疫性疾病发病有关[21]，提示启动子区高甲基化是BD患者IL-10基因失活的关键机制之一。Zhu[22]等对16 名活动期BD患者、11例非活动期BD患者及19个健康对照组CD4+T细胞中的转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白介素4(Interleukine-4,IL-4)及GATA 结合蛋白-3(GATA-3)CpG启动子区域的DNA甲基化及mRNA表达水平进行了研究，结果表明，与健康个体相比，活动期BD患者中GATA3和TGF-β的甲基化水平显著升高且mRNA表达显著降低，非活动期BD患者GATA3启动子区域CG-7.8.9位点较活动期BD患者甲基化水平显著降低；同样，与活动期BD患者相比，非活动期BD患者TGF-β中CG-2.3.4.5和CG-10.11位点的甲基化水平也显著降低；在使用了糖皮质激素和环孢素治疗后，非活动期BD患者的GATA3和 TGF-β甲基化水平降低，提示GATA3 和TGF-β的异常DNA甲基化与它们的mRNA表达相关，且GATA3和TGF-β启动子区域的高甲基化可能导致其基因转录沉默，进而参与BD的发病。Abdi等[23]检测BD患者和健康对照组外周血中细胞因子信号转导抑制因子1(Suppressors of cytokine signaling 1,SOCS1)基因的甲基化水平，结果显示，与健康对照组比，BD患者组中SOCS1甲基化水平升高，且BD患者组中SOCS1基因表达的水平较健康对照组显著降低，进一步揭示了BD患者SOCS1基因启动子DNA甲基化程度与基因表达活性程度呈负相关，SOCS1 基因甲基化水平增高可能是最终导致BD的发病原因之一。Qiu等[24]对BD患者及健康对照组树突状细胞( Dendritic cell,DC)中干扰素调节因子8(Interferon regulatory 8,IRF 8)CpG启动子区域的DNA甲基化水平进行了研究，结果显示，活动期BD患者IRF 8甲基化水平显著高于非活动BD患者及正常对照组，且活动期BD患者的IRF8基因mRNA表达健康对照较显著降低；研究还发现，DAC处理能降低IRF8基因CpG位点甲基化水平，进而增强IRF8基因的mRNA表达，提示IRF8的表观遗传调控可能为BD治疗的新靶点。

综上所述，异常DNA甲基化可能通过调控目标基因的表达，参与BD的发病。因此，异常DNA甲基化位点可能成为BD诊断的生物标志物和治疗靶点。

2 组蛋白修饰与BD

组蛋白修饰(Histone modification)是指组蛋白在相关酶作用下发生甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等修饰的过程。组蛋白修饰是表观遗传调控的重要手段之一，已有研究已经证实，组蛋白乙酰化主要与基因激活有关[25]。近年来，组蛋白修饰在自身免疫性疾病中的作用已被广泛关注，且与BD的发生也有一定关联。

SIRT1 (Sirtuins 1)是一种依赖NAD+辅酶的组蛋白去乙酰化酶，通过对组蛋白进行去乙酰化修饰，调控基因的表达，进而调节细胞功能存活及调节炎症[26]。Gardner等[27]研究发现，SIRT1激活物通过下调STAT5A / B的表达和抑制对IL-2的pSTAT5A/B信号传导，从而抑制T细胞增殖。对实验性自身免疫性葡萄膜炎(Experimental autoimmune uveitis,EAU)小鼠进行口服SIRT1激活剂治疗可抑制疾病的发展，并伴有视网膜白细胞浸润的减少，抑制抗原特异性T细胞反应，降低了包括IL-6、IL-17A和干扰素-γ等促炎细胞因子的产生，进而抑制EAU的发展。前期已有研究发现，IL-6、IL-17等细胞因子在BD发病中发挥着重要作用[2]。因此，未来对SIRT1的靶向激活有望成为BD的潜在治疗方法。Kubota等[28]通过对注射脂多糖诱导的葡萄膜炎(Endotoxin induced uveitis,EIU)小鼠喂饲白藜芦醇，研究白藜芦醇在内毒素诱导的EIU中的眼部作用，结果显示，白藜芦醇给药可以显著降低单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和细胞间黏附分子1(Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的蛋白水平以及核因子-κB (Nuclear factor-κB，NF-κB)水平；与对照组相比，视网膜血管白细胞黏附能力也显著降低，抑制眼部炎症反应的发生；除了具有抗氧化作用外，白藜芦醇还可作为组蛋白脱乙酰基酶Sirt1的活化剂，白藜芦醇能够显著增强Sirt1基因在EIU小鼠视网膜色素上皮细胞和脉络膜中的表达，SIRT1激活物可抑制与BD的发展，因此SIRT1激活物可能是BD潜在的药物靶点。

综上所述，组蛋白修饰参与了BD的发生发展，但相关的研究偏少且不够深入，其参与BD发生的具体机制有待于进一步研究。

3 非编码RNA与BD

非编码RNA(Non-coding RNA)是指不编码蛋白质的RNA，包括微小RNA(microRNA，miRNA)、短干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)、piRNA(piwi-interacting RNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)。人的基因组大概含有32亿个碱基，编码蛋白的基因仅占全基因组的1%～2%，而剩余的98%都是非编码DNA。近年研究表明，非编码RNA在各种复杂性疾病的调控中起到非常重要的作用。目前研究最多的是miRNA，其长度约为22个核苷酸，也是一种转录后调控因子，通过对靶基因的调控进而参与细胞增殖、分化及凋亡等过程。miRNA自身表达的调控机制尚不明确，单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP )为其调控机制之一，其主要通过miRNA基因中的SNPs对miRNA表达活性进行调节，从而通过调控靶基因产生生物学效应[29]。目前，多项研究表明，miRNA可能成为BD潜在的生物学诊断标志。

Antonio等[30]使用Affymetrix阵列分析法，全面覆盖miRNA序列分析BD患者及正常对照组miRNA的表达谱，鉴定了BD中47组差异表达的miRNA，其中miR-4505和miR-149-3p较对照组表达显著升高，其余45组miRNA表达显著降低；研究还确定了与活动性BD患者相关的特定miRNA特征，这些失调的miRNA通过靶向信号传导途径参与BD的发生，如TNF、IFN-γ、VEGF和VEGFR信号转导通路等。Woo等[31]分析了BD患者PBMC中miRNA(miR-638、miR-4488、miR-3591-3p和miR-1915)的表达水平，分析结果显示，与健康对照组相比，静止期BD患者的miR-638和miR-4488 的表达水平降低；相较于静止期BD患者，活动期BD患者的miR-3591-3p表达显著增加；在脂多糖刺激下，活动期BD 患者PBMC中IL-6表达显著上调； BD患者PBMC中分别转染miR-638和miR-4488抑制剂以及miR-3591-3p模拟物后，可显著增加IL-6 mRNA表达水平。该研究探索了BD患者的PBMC中相关miRNA的差异表达，并表明miRNA可对IL-6的产生起到调节作用。Zhou等[32]研究发现，与健康对照组相比，BD患者PBMC和DC中miR-155表达显著减少，而蛋白激酶结合蛋白2表达增加；体外实验表明可通过改变miR-155水平调控靶基因TAB2蛋白水平的表达，发挥树突状细胞的细胞因子的作用，进而参与BD发病。Qi等[33]对miR-196a2的SNP进行了两阶段关联研究，第一阶段的研究结果显示，BD患者miR-196 a2/rs11614913 TT基因型和T等位基因频率较正常对照组显著增高，而CC基因型在BD出现频率显著降低；第二阶段的研究证实了rs11614913 TT基因型与CC基因型和C等位基因相比miR-196a表达减少，且miR-196a靶基因Bach1、炎症因子IL-1β和MCP-1的表达增加；该研究揭示，rs11614913的miR-196a2表达的改变与BD的发生发展显著相关，其主要通过调节基因表达与促炎细胞因子的产生，进而参与BD的发病。Qi等[34]采用荧光定量聚合酶联反应、流式细胞术等探讨Notch信号通路与相关miRNA在BD中的作用，结果发现在BD活动期，Notch信号通路参与反应途径且增强，使用DAPT阻断Notch信号通路后能明显抑制IL-17的产生及Th细胞的数量，表明其主要通过激活与信号转导因子和转录激活因子(STAT3)磷酸化相关的Notch通路，促进Th17细胞反应，导致BD的发病。此外，与Notch1相关的miRNA中，仅miR-23b在BD患者CD4+T细胞中表达降低，揭示miR-23b在活动期BD的低表达是导致Notch信号通路异常和发病的主要原因。Zhou等[35]研究发现，与正常对照组相比，BD患者中miR-146ars2910164位点CC基因型和C等位基因的频率显著降低，且该GG基因型个体miR-146a的表达分别比CC基因型和GC基因型高2.45倍和1.99倍，rs2910164位点 CC基因型在PBMC中IL-17和IL-1β的表达水平显著低于GG基因型，该研究确定了中国汉族人群中miR-146a的rs2910164多态性与BD的相关性，且该SNP可能通过调节成熟miR-146a/表达和促炎细胞因子的产生，进而参与BD的发生。

近期研究表明，其它非编码RNA如lncRNA的异常表达与自身免疫性疾病的发生与发展密切相关[36-37]。lncRNA是炎症免疫反应的重要调节因子，在各种生理过程中起着重要作用，包括转录、染色质修饰及转录后的处理[38-39]。已有研究证实110个lncRNA的SNPs与Vogt-小柳原田综合征、强直性脊柱炎等多种自身免疫性疾病的发病有关[40-41]，但参与BD发病的lncRNA及其具体机制仍有待进一步研究。

综上，正确认识非编码RNA参与BD发生的作用机制，将为BD的诊断与治疗提供新的策略。

4 展望

本文通过探讨异常DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA在BD发生发展中的重要作用，这加深了我们对BD的病因病理学的理解。然而，目前表观遗传因素参与BD发生的具体作用机制研究偏少，尚不能完全解决BD缺乏防治和预后特异性生物学标记物的难题。未来仍须更深入的研究表观遗传因素发生异常的原因及其作用机制，新的研究结果将可能为BD的临床诊断、治疗和预后提供新的途径或新的靶点。