纺锤体检验点蛋白在卵母细胞减数分裂过程中的研究进展

张 越 孙洪亮 王成祥 种海玲 李清春

滨州医学院附属医院生殖医学科，山东滨州 256600

随着卵泡生长，雌性哺乳动物生殖细胞首先发育为初级卵母细胞，进入生发泡期（germinal vesicle，GV），并暂时停留在GV 期；减数分裂恢复的标志是生发泡破裂（germinal vesicle breakdown，GVBD），随后微管蛋白开始组装成微管，染色体开始形成，进入第一次减数分裂前期，此时同源染色体联会，四分体形成；当所有四分体排列在赤道板上时，即到达第一次减数分裂中期（MⅠ期），随后进入第一次减数分裂后期（AⅠ期），同源染色体分离，此时称为第一次减数分裂末期（TⅠ期），同时排出第一极体；随后卵母细胞第二次减数分裂的纺锤体迅速形成，卵细胞停留在第二次减数分裂中期（MⅡ期）等待受精完成[1-2]。在卵母细胞减数分裂整个过程中，纺锤体检验点（spindle assembly checkpoint，SAC）在分裂中后期发挥着重要作用，保证双极纺锤体形成、完成染色体与微管的连接以及在进入后期之前完成染色体在赤道板上的排列[3]。卵母细胞减数分裂是一个复杂的生物过程，最终准确完成二倍体的亲代细胞产生单倍体的配子。

然而，SAC 在卵母细胞减数分裂过程中的功能研究仍存在很大的争议。酵母和苍蝇在没有功能性SAC的情况下仍可以有效地完成染色体排列[4]。而SAC 对高等生物的生存繁育至关重要[5]。研究证明[3]，SAC 系统参与雌性哺乳动物卵母细胞减数分裂的调控，防止胚胎非整倍体的发生。本文为了更好地认识SAC 蛋白在卵母细胞减数分裂过程中的调控机制，分别探讨了四种SAC 蛋白在卵母细胞减数分裂过程中的定位及对非整倍体发生的作用机制。

1 激酶B

激酶（Aurora）为丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白家族亚类，包括Aurora A、Aurora B、Aurora C；Aurora B 是染色体乘客复合体（chromosomal passenger complex，CPC）的一员，是对正确调节染色体排列、胞质分裂和动粒-微管相互作用所必需的，被认为参与了SAC 信号的维持[6-7]。Aurora B 在细胞周期中是动态定位的，有丝分裂中期集中在内部着丝粒染色质，后期定位于纺锤体中间带[8]。在哺乳动物细胞中，Aurora B 功能丧失会影响TERF1/TRF1（端粒保护蛋白复合物的一个组成部分），进而导致端粒结构异常[9]。而Aurora B 的扩增或表达增加已被证明与各种人类恶性肿瘤的不良预后有关[10]。

Aurora B 控制动粒-微管的附着，调节有丝分裂和减数分裂中的关键事件，如凝聚蛋白结合和染色体凝聚、染色体定向、中央纺锤体的形成、染色体臂及端粒的分离等[11]，是影响染色体分离和动粒微管结合的关键因子。Aurora B 在染色体正确分离和维持基因组的完整性中起着十分重要的作用，在动粒正确地附着在微管之前，始终保持其活性[12]。Aurora B 主要是通过磷酸化修饰激活底物发挥生物学功能，它负责细胞有丝分裂过程中组蛋白H3 丝氨酸Ser10 的磷酸化（H3S10P），H3S10P 已被证明是Aurora B 活性激活的标志[13]。实验证实，H3S10P 参与猪卵母细胞减数分裂过程，并影响猪胚胎有丝分裂的细胞周期进程[14]。Chen 等[15]研究显示，小鼠胚胎的第一次分裂过程中，抑制Aurora B 影响了早期胚胎的发育，表明Aurora B是SAC 成分[如有丝分裂阻滞缺陷蛋白2（mitotic arrest deficiency 2，Mad2）]定位到动粒所必需的，可能通过参与SAC 来调节染色体分离及防止第一次卵裂相关的非整倍性事件的发生。Aurora B 通过破坏不正确的动粒-微管连接影响有丝分裂检查点功能，是胚胎发育过程中调节染色体异常关键的有丝分裂调节因子，它在防止体外受精胚胎染色体非整倍性的发生和降低植入前失败率方面起着重要作用[6]。

2 纺锤体检验点蛋白E

纺锤体检验点蛋白E（centromere-associated protein E，CENP-E）是有丝分裂动粒纤维层的组成部分，它包含一个ATP 水解运动域，促进微管末端定向运动[16]。人类CENP-E 由2701 个残基组成，CENP-E 的动粒靶向结构域包含残基2126-2476，其后是微管结合区；人类CENP-E 结构域包含四个半胱氨酸残基，每个半胱氨酸残基都是其马达结构域运动所必需的[17]。分子动力学模拟显示，人类CENP-E 的Y63H突变体降低了其ATP 结合亲和力，破坏了CENP-E 马达结构域的ATP 结合区的构象，并与癌症进展相关[18]。CENP-E是一种纺锤体检验点蛋白，参与其他检验点蛋白与动粒结合，如有丝分裂检验点蛋白BubR1 抗体（mitotic test point protein BubR1 antibody，BubR1）、 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1 （budding uninhibited by benzimidazole 1，Bub1）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3（budding uninhi bited by benzimidazole 3，Bub3）、有丝分裂阻滞缺陷蛋白1（mitotic arrest deficiency 1，Mad1）和Mad2。CENP-E 在核膜破裂后不久就与动粒结合，在中期到后期转换过程中，CENP-E 表现出从动粒到中央纺锤体中部的动态分布，在分裂的后期或末期，它被重新定位到纺锤体微管[19-20]。研究表明[21]，小鼠卵母细胞中注射抗CENP-E 抗体后完全阻止了卵母细胞进入AⅠ期，所有卵母细胞在MⅠ期被阻断，这表明CENPE 参与减数分裂过程的染色体运动。CENP-E 的抑制或耗竭导致严重和持久的染色体排列缺陷，许多染色体无法向纺锤体赤道板方向排列，并停留在纺锤体极点附近，导致SAC 逐渐地激活[16，22]。Tovini 等[23]采用CENP-E 抑制剂抑制体细胞后，导致染色体排列错乱。

CENP-E 是一种末端定向的驱动马达蛋白，是中期染色体组装所必需的，它在动粒外层累积，并介导动粒-微管的捕获，沿着纺锤体微管向赤道板运输染色体；CENP-E 在动粒-微管连接过程中与BubR1、Aurora B 和核心动粒成分相互作用，它参与有丝分裂和减数分裂过程中的动粒-微管捕获、 中期染色体组装和排列、纺锤体组装检查点的调节[24]。染色体排列过程中微管捕获和结构维持需要CENPs[25]。此外，CENP-E 通过姐妹染色单体的横向滑动介导染色体分离，在缺乏CENP-E 的情况下，Aurora B 保留在着丝粒处，并表现出高度Aurora B 激酶活性，这导致纺锤体组装检查点的激活；Aurora B 与CENP-E 相互作用，通过减少近极端动粒-微管的稳定附着来调节单向极性染色体组装[26]。

3 Mad1

Mad1 是有丝分裂检查点蛋白中进化上较保守的核心蛋白之一，人Mad1 是一种由718 个氨基酸组成的蛋白质，Mad1 的全长结构尚未破解，主要是由于重组Mad1 的溶解度低[27]。Mad1 的N 端结构域（1～485 个残基，Mad1NTD）被认为是将蛋白质靶向结合到核膜或动粒所必需的，并与许多其他蛋白质相互作用[28]。Mad1 通过其中间区域的Mad2 相互作用基序（Mad2-interacting motif，MIM）与Mad2 形成独立的细胞周期复合物，这种复合物富含未附着的动粒，构成有丝分裂检查点的信号放大机制；Mad1 作为最重要的检查点蛋白之一，还可以形成一个细胞周期独立的Mad1:CMad2 复合物，以催化Mad2 O-C（open-closed）在未附着动粒上的转化，从而放大有丝分裂检查点的信号[27]。

近年来，国内外文献对Mad1 与Mad2 比率（Mad1∶Mad2）在减数分裂纺锤体检查点中的作用进行了研究报道。不论Mad1 和Mad2 蛋白的总量是否只有正常水平的一半，染色体丢失方面的缺陷可以通过恢复Mad1∶Mad2 的补偿性变化来逆转[29]。由此得出，在检查点功能的某些方面，Mad1∶Mad2 比Mad 蛋白质总量更具有代表意义。

4 Bub1

Bub1 为Bub 家族成员之一，在减数分裂纺锤体检查点功能中起着重要的作用，在小鼠卵母细胞GVBD 期到AⅠ早期Bub1 定位于动粒上，并于AⅠ晚期在动粒上消失，而在MⅡ期重新定位于动粒上[30]。Bub1 决定许多靶标的动粒募集，包括CENP-E、CENP-F、Bub3、Mad3/BubR1、有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白、Mad1 和Mad2[31]。

敲除细胞Bub1 基因显示染色体组装缺陷，导致染色体分离错误[4]。Bub1 保守的C-末端尾部在调节染色体组装中起作用，且负责CENP-F 的募集，独立于激酶活性。根据最近在HeLa 细胞中的另一项研究[32]，Bub1 的C 末端可能会招募更多的下游靶点，因为Bub1 与许多动粒蛋白的招募有关。在人类细胞中，通过RNA 干扰（RNA interference，RNAi）敲除Bub1 也会导致染色体排列错误及导致明显的SAC 缺陷[33]。

5 小结

细胞分裂是一种由多种蛋白质调控通路参与的复杂的生命活动，各种蛋白的功能、作用途径、调控方式相互作用，确保细胞分裂正确进行。纺锤体检查点通过暂时停止染色体分离和随后的细胞分裂来确保基因组的保真度，直到所有动粒有效地附着到纺锤体上；SAC 对动粒-微管连接状态的反应被精细调节，使得未连接的动粒产生足够的“等待后期”信号来阻止细胞分裂；一旦完成染色体的配对，纺锤体蛋白便从动粒上释放，SAC 被灭活，使细胞进入后期[3]。除了本文介 绍 的SAC 蛋 白Aurora B、CENP-E、Mad1、Bub1四种SAC 蛋白之外，还有另外一些检验点蛋白，比如BubR1、Mps1、Dynein 等，它们都在减数分裂及有丝分裂的纺锤体组装及染色体排列中发挥了重要作用。影响减数分裂过程因素的不仅仅有SAC 蛋白，还有其他作用机制，比如环境、年龄、类泛素蛋白修饰分子（small ubiquitin-like modifier，SUMO）修饰[34]等。相关文献表明[35]，年龄对卵母细胞质量有很大影响，高龄妇女发生染色体非整倍体的比率较高，与纺锤体微管的偏移和错配密切相关。SUMO 化修饰是一种蛋白质翻译后修饰途径，参与了细胞增殖、分化、凋亡以及周期调控等众多生理调控过程[36]。SUMO-1 可能在促进胞质分裂和维持第二次减数分裂纺锤体组装检查点方面发挥重要作用[34]。关于SUMO 修饰对减数分裂过程的影响、甚至导致非整倍体的具体分子机制还有待进一步的研究。总之，减数分裂这一过程需要多方面协同作用，正确认识及研究SAC 蛋白的检测机制，对防止减数分裂染色体排列或分离异常及防止非整倍体的发生具有重要的意义。

目前，关于纺锤体检查点蛋白在卵母细胞减数分裂过程的作用研究取得了一定的进展，但是关于纺锤体装配机理及途径，SAC 是如何准确监测及调节染色体运动、 各种SAC 蛋白又是如何协同作用来保证减数分裂正常进行的证据仍比较有限，有待于更进一步的研究。相信随着生物学技术的进步，上述未能准确阐述的过程和机制定会得到完善，从而为减数分裂异常导致的非整体的发生及治疗提供理论依据。