眼底成像系统在视网膜色素上皮细胞黑色素检查中的研究进展

袁 景，郭从容，马菲妍,2*，尚庆丽，马景学

(1.河北医科大学第二医院 眼科，河北 石家庄050000;2.深圳市新产业眼科新技术有限公司)

视网膜色素上皮(Retinal Pigmented Epithelium，RPE)细胞是位于视网膜光感受器底层的单层上皮细胞，其细胞膜具有选择透过性。RPE细胞的主要功能是将营养物质和生长因子从脉络膜毛细血管转运至光感受器，起到血眼屏障的作用;吞噬视网膜代谢终产物、消化光感受器外节膜盘并生成新的膜盘，从而保证光感受器的正常功能;促进损伤后的再生和修复[1]。这些功能的异常可导致视网膜变性、光感受细胞死亡，最终导致视力丧失。RPE细胞中的黑色素对其周边结构有重要的保护作用，它可吸纳光感受细胞无法吸收的多余光，保护视网膜免受光产生的氧活性物质的影响。但RPE细胞中的黑色素不可再生，随着光照、年龄等因素的影响逐渐累积，RPE则会表现出异常[2]。因此，对RPE细胞中的黑色素的定性定量检测有助于提早发现视网膜相关病变。

1 基于LED光源的眼底成像系统

1.1 彩色眼底照相(Fundus Color Photography，CFP)

眼底照相是一种传统的临床成像方式，产生视网膜的二维、正面彩色图像，大多数现代台式眼底系统的视野约为 45°，不需要散瞳。眼底系统的基本组成部分是白光光源，照明路径中有中央环形遮挡片、物镜、变焦镜头，以及用于检测图像的摄像机。环形孔径可在瞳孔处形成环形照明模式，在视网膜处形成环形照明模式，并在摄像机处检测到圆形图像。瞳孔处的环形照明模式减少了来自角膜的反向反射，并允许更好地检测来自视网膜的反射光。照明和收集路径可以与分光器或带中心孔的镜子结合，在传输收集光的同时使照明路径偏转[2]。

彩色眼底照相是临床初步诊断中的基本检查，部分疾病的临床分级是依据眼底彩色照相进行的，例如年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration，AMD)，眼底照相中脱色素改变或色素堆积改变是其分级中的评估指标之一[3]。但彩色眼底照相的弊端是无法区分RPE细胞色素改变和脉络膜色素改变，并且无法定量检测。为了能够定量检测色素，在彩色眼底照相的基础上发明出眼底反光测量仪。

1.2 眼底反光测量仪

眼底反射测定法基于视网膜光密度计测量(retinal densitometer)，该仪器由光源、改变入眼照射光波长的滤光片、可定量检测视网膜反光的检测器(光电倍增管)组成[4]。拍摄过程中先利用高强度白光漂白视网膜后，以较低光强的特定光谱(例如500 nm)进行二次照射，反射光的强度量化后可评估眼底色素的光密度强度。

眼底反光测量仪目前主要用于定量评估黄斑色素，包括视锥色素、视紫红质和黑色素[5]。但眼底反光测量仪并未在临床中推广使用，主要原因是其测量计算模型复杂、结果的稳定性和一致性较差。导致结果稳定性和一致性较差的主要原因是由于屈光介质混浊以至于发生不同程度散射，以及不同层次组织的吸收程度变异较大。除此以外，眼底反光测量仪的结果输出为数字，仅有少数模型可以形成二维平面图，临床解读较困难，因此未能在临床上推广使用。

2 共聚焦扫描激光检眼技术

扫描激光检眼镜(Scanning laser ophthalmoscopy,SLO)的出现为眼底荧光造影、自发荧光成像、广角成像(wide-field SLO)、自适应光学SLO奠定了基础。SLO最早由Webb 团队报道于1981年，并随后发展为共聚焦扫描激光检眼技术[6]。其成像原理是在视网膜上投射低功率激光光束，以光栅(raster)方式对眼底进行扫描，具有成像快、分层扫描等优点，可以在非接触情况下实现200°视网膜成像[7]。视网膜各个点位的反射信号可通过共焦针孔后被探测器记录，生成二维图像。离焦光束信号在成像过程中被抑制，因此，图像的对比度得到增强、性噪比较优。这种对离焦光束的抑制程度随着离焦的程度成比例，尤其是来自于晶状体或角膜的信号源受到显著信号抑制，所以可有效减少晶状体和角膜干扰、降低光线在眼内的散射，成像清晰度高、对比度好[8]。SLO技术逐步融入其他技术模块(如眼追踪技术)，形成了高清眼底荧光造影、蓝光自发荧光、近红外自发荧光等组合成像方式。以下将从针对RPE细胞中色素成像角度进行梳理。

2.1 近红外自发荧光(Near-infrared autofluorescence imaging,NIR-AF)

在2006年由世界气象组织主办的山洪预报国际研讨会上，与会人员提出开发一套适合全球应用的山洪预警系统。目前，山洪预警系统（FFG system）正在通过一系列区域性项目在一些国家和地区推广应用。已经实施的项目分布在中美、南非、黑海和中东等地区，一个原型系统已经自2011年在巴基斯坦开始运行。其应用的基础数据是利用美国卫星可获得的卫星降雨估算场、数字高程模型、遥感影像数据和地理信息系统。基于这些数据，可进行小流域基础信息提取和降雨径流分析计算。

眼底自发荧光(Autofluorescence，AF)是一种可以反映RPE代谢活力的检测工具，它能显示RPE细胞中脂褐质及发生在神经视网膜层下和外层视网膜疾病中的荧光团的分布情况。根据眼底发光体的不同，眼底自发荧光有几种类型，目前已经研究明确的主要有两种，即脂褐质相关蓝光自发荧光(Fundus Autofluorescence，FAF)和黑色素相关NIR-AF，前者是依赖于RPE细胞中的脂褐质中的双重类视色素(bisretinoids)的一种荧光形态，后者主要是来源于RPE层细胞中和脉络膜层中的黑色素颗粒，Piccolino等人在1996年的一项研究中首次用捕捉到了视网膜中黑色素在近红外光中的自发荧光信号[9]。NIR-AF近年来成为大家研究的热点，该荧光的激发波长为795 nm，滤过波长为800 nm，其发射光经计算机处理数据后，可以将RPE细胞内黑色素的分布情况描绘出来，其受RPE层前自发荧光材料物质以及吸光度的影响，基于这些特性，NIR-AF是一种研究外层视网膜的很好的非侵入性的影像工具。

NIR-AF可用于AMD各期病变观察，例如早期AMD地图样萎缩，也可用于视网膜变性疾病，包括视网膜色素变性、鱼雷样黄斑病变、Best卵黄样黄斑病变、Stargardt 病、炎症相关改变如一过性白点综合征、Vogt-Koyanagi-Harada病等[10-11]。但NIR-AF明显的弊端为轴向分辨率差，无法对色素的三维分布进行成像，RPE细胞的黑色素和脉络膜黑色素无法分离、信号叠加，无法在不同患者的NIR-AF图中实现色素浓度定量测量[12]。

2.2 荧光寿命成像(Fluorescence lifetime imaging ophthalmoscopy,FLIO)

荧光寿命定义为视网膜脉络膜中自发荧光信号和荧光物质被激发后荧光信号持续的时间，荧光寿命测量反映的是分子受到光脉冲激发后返回基态之前在激发态平均停留的时间[13]。眼内黑色素家族是由真黑色素(Eumelanin)和嗜镉黑色素(pheomelanin) 组成。真黑色素在棕眼人群中更普遍，嗜镉黑色素在蓝眼睛或绿眼睛人群中更多见。黑色素的荧光衰减较复杂，其荧光寿命短则持续数皮秒，长可持续至8纳秒。细胞中的黑色素、脂褐素及黑色脂褐素颗粒具有十分活跃的自由基，被可见光或紫外线照射后易被激活，在氧化状态下，黑色素的激发光为450 nm-470 nm，发射波长540 nm[14]。目前FLIO主要应用于激光眼底损伤、视网膜色素变性、中心性浆液性视网膜脉络膜病变、Stargardts病等疾病的影像学辅助诊断[15]。

2.3 自适应光学扫描激光检眼镜(AdaptiveOptics，AO)

人眼内部存在像差，人眼像差的测量依赖于基于Hartmann-Shack原理设计的波前像差感测器，像差的测量结果可通过可变形镜面进行校准，其中可变形镜面由其背面大量推动杆(电子控制)进行调整，调整精度可达到2 μm。因此将波前像差校准技术与现有的光学成像技术相融后，即形成“自适应光学”。自适应光学成像可达到细胞水平的清晰度，且无创。自适应光学成像过程中，对于病变位置进行扫描，其反射光经过人眼屈光系统的折射发生方向偏移，进入波前像差感测器后反射光的偏移量可对可变形镜面进行调整，并对人眼的像差进行屈光补偿，此过程反复循环，直至眼球像差校正至近衍射极限水平，同时采用另外一个光源(非相干光)进行闪光拍照，并记录在眼底照相或扫描机光检眼镜中[16]。

目前自适应光学可实现细胞水平成像，呈现色素上皮层的六角形结构，可直接观察色素上皮细胞的形态，其原理决定其成像特点无法直接观察色素改变，且其扫描效范围较小(5°)、成像效率较低，故限制其临床使用[17]。目前该技术已应用于AMD、Stargardt病、Vogt-Koyanagi-Harada病等眼底疾病的诊断[18-19]，均可呈现色素上皮细胞壁的微细结构改变，但其在提示RPE细胞色素改变中的价值需进一步探索。

3 光学相干断层成像(Optical coherence tomography，OCT)

OCT首次出现于1996年，现已成为临床诊断和随访的标准成像技术。OCT的工作原理是采用近红外光扫描视网膜时，不同组织界面会产生不同的光反射强度和时间延迟，利用干涉测定仪测定近红外光返回脉冲的延迟和强度变化的关系，由计算机系统对不同反射强度用不同的伪彩色进行标记和处理，形成高分辨率活体组织的OCT横断面图像。光线先输入一个光束分离器、一个样品臂(如视网膜)和一个参考臂组成的干涉仪。结果干涉图的傅里叶变换被用来获得作为深度函数的OCT信号。因此，处理后的OC是一个复杂的信号，信号的幅度和相位都随深度变化。单个OCT扫描(A-scan)是一个一维的测量样品反射系数作为深度的函数。对样品上的OCT光束进行光栅扫描，可以得到二维和三维的图像。在伪彩色图像中，最前面的红色反射为视网膜神经纤维层(Retinal nerve fiber layer,RNFL)，以颞上和颞下最厚。此外,OCT还能分辨出视网膜的其他层次结构，在RNFL的下方依次为内外丛状层(黄色反射)、光感受器细胞层(暗区)和色素上皮与脉络膜毛细血管层(红色反射)。通过计算机系统的进一步处理，可以得到各层次组织厚度等相关数据[20]。OCT典型的横向分辨率可小至1.5 μm和9 μm，取决于物像和光源的波长。轴向分辨率由成像源的波长和带宽决定，在一定程度上，较小的波长和较大的带宽可以获得更好的分辨率。眼OCT系统通常会集中在850-860 nm，50到100 nm带宽,轴向分辨率3 μm和6 μm之间。利用这种组织对比机制和高轴向分辨率，可以在OCT图像上分辨出不同的组织层，如神经纤维层、光感受器、RPE等。OCT中 RPE层表现为外层视网膜连续、完整的反光带，但OCT图像的主要对比对象是背景反光，无法针对色素特异的成像，也无法评估色素的功能性改变。因此为了更好地观察RPE细胞色素，在OCT基础上进一步发展出偏振敏感OCT和光热OCT。

3.1 偏振敏感OCT (PS-OCT)

PS-OCT提供了样品的双折射信息，已被用于角膜和视网膜成像。要进行PS-OCT，入射的OCT光必须循环极化。通过样品后，样品组成决定了发出的光可保持椭球偏振模式。单个探测器被用来测量极化光的垂直和水平分量。采用不同的算法提取样品的偏振特性，然后将其映射到深度分辨的OCT强度图像上[21]。有人利用黑色素在RPE中探测到PS-OCT信号的来源，发现极化均匀度与黑色素浓度相关，这一结果后来在大鼠身上得到证实[21]。然而，这种关系强烈依赖于样本的颗粒分散特性，即黑色素颗粒的大小和形状。PS-OCT已被用于从2D或3D OCT数据集中采集到AMD、RPE脱离和假卵黄样营养不良的患者的RPE形态，并可用于计算视网膜或脉络膜厚度。

3.2 光热OCT (PT-OCT)

PT-OCT是另一种功能性OCT技术。PT-OCT可检测组织中的光学吸收物，其分辨率和成像深度与OCT类似，利用了光热效应，即对比剂(如黑色素)吸收的光子以热的形式重新发射。为了进行PT-OCT，将调幅激光器与相敏OCT系统相结合，该附加激光器的波长与造影剂的吸收峰相对应。光子吸收后的温度升高会导致吸收器周围的热弹性膨胀，并改变组织的折射率。它被检测为OCT相位信号的变化，且PT-OCT信号强度与组织的吸收系数成正比[22-23]。PT-OCT首先在眼睛中进行，在色素小鼠的RPE中检测到黑色素信号，对照组白化小鼠中没有相应信号[24]。后续研究是在斑马鱼中进行的，斑马鱼每只眼睛的RPE中都有色素和非色素区域[25]，PT-OCT信号对斑马鱼眼黑色素具有特异性。PT-OCT还通过比较适应黑暗和适应光的野生型斑马鱼，检测了RPE内的黑素体迁移。

PS-OCT和PT-OCT都被认为是功能性OCT技术。它们能产生像OCT这样的高分辨率图像，而且都能获得视网膜的体积图像，这些图像与OCT强度图像完美地重合。无论是PS-OCT还是PT-OCT仪器，都可以与OCT血管造影等其他方式相结合进行多模态成像。

4 多光谱眼底分层成像(multi spectral fundus imaging system，MSI)

光谱学(Spectroscopy)是研究物体对光的反射特性的学科，通过测量特定光谱的反射强度提示物质的特定组成(光谱指纹)，其在生物医学领域亦称光谱成像(spectral imaging)，可用于分析光谱物质的空间分布。在眼科领域，目前应用技术有两种，多光谱技术(Multispectral Imaging)和高光谱技术(Hyperspectral Imaging)。光谱技术有两方面应用，第一是眼底病灶的物质组成分析，例如MSI；第二是通过不同光谱的图像信息对比，进行眼底血氧代谢分析。后者暂不在本文中讨论。

多光谱一般采用5-10个光谱波段，波段宽度为5-10 nm，为非连续光谱；高光谱一般采用光谱较密集，可达到100个或以上扫描波普，波段宽度2-3 nm。光谱可包含可见光、红外光，短波长在眼内组织内穿透能力较弱，达到眼底浅层组织即发生反射和散射，主要对浅层组织进行成像，而中波长即近红外波长穿透力强，可达到外层视网膜、RPE和脉络膜层。MSI是使用不同的光波长度的发光二极管(LED)改进技术，范围从550纳米(绿色)到850纳米(红外线)，以检查视网膜层和脉络膜。机器中的图像形成取决于入射光的波长和反射光的波长。因为在视网膜的不同层和不同组织在相同层中的颜色不同，MSI可以显示从视网膜到脉络膜清晰的视野。MSI在临床上多用于糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)、息肉样脉络膜血管病、视网膜静脉阻塞等疾病的检查诊断[26]。MSI在PRE色素病变中的应用包括：AMD相关色素上皮改变的形态学观察[27]、nv-AMD中RPE的观察、VKH色素改变、脉络膜肿瘤对色素上皮变化的观察等[28]。其主要弊端为基于LED系统的光谱照相系统容易受到晶状体散射的影响，影响图像质量。由于目前MSI图像无法精准分层，需要结合SLO或OCT成像系统对成像平面精准定位。

5 总结

近年来，随着电子设备和成像技术的完善和创新，视网膜色素眼底成像，从传统的彩色眼底照相发展到现如今的光学相干断层成像、多光谱成像等先进成像技术，为广大眼底疾病发展进程中的各种形态学特征改变提供了极大的帮助，不过现有的成像技术也依然存在各种各样的短板和局限性。

彩色眼底照相可进行初步色素的定性分析，眼底反射测定法虽然可以定量检测RPE细胞中的黑色素，但分析模型复杂，因此难以在实践中实施；NIR-AF易于临床解读，但很难将脉络膜黑色素和RPE细胞黑色素分离；AO可呈现色素上皮层的六角形结构，能直接观察色素上皮细胞的形态，但无法直接观察色素改变，且其扫描效范围较小(5°)、成像效率较低；OCT能分辨出不同的组织层，如神经纤维层、光感受器、RPE等，但无法针对色素特异成像，也无法评估色素的功能性改变；多光谱眼底成像和高光谱眼底成像可利用窄光谱成像技术，对视网膜脉络膜进行多层成像，也可单独提取色素上皮信息相对丰富的层次，但尚未实现精准分层。

不同眼底成像系统从不同角度呈现RPE细胞中的黑色素分布和形态变化，为临床提供多种诊断信息，有利于疾病的综合分析和判断。