线粒体离子肽酶1的结构与功能及其在常见恶性肿瘤中的表达和作用

吴晓涵 陈绍水

滨州医学院附属医院肿瘤科，山东滨州 256600

线粒体提供了细胞生命活动所需能量的80%，被喻为机体的“能量工厂”，维持线粒自身的稳态是保证机体细胞正常活动的基础。作为细胞能量和代谢的中心，线粒体可通过氧自由基清除、蛋白水解系统、蛋白酶体系统、线粒体裂变和融合及线粒体自噬[1]等方式维持自身稳定。其中，线粒体离子肽酶1（lon peptidase 1，LONP1）是保障线粒体功能和蛋白质稳定的主要蛋白酶之一。LONP1蛋白于1981年在大肠杆菌中被首次发现[2]，后于1993年被Kutejova等[3]在酵母菌中分离。此蛋白由6个亚基组成，包含963个氨基酸，相对分子质量为106 000[4]。作为一种细胞核内脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）所编码的线粒体酶，LONP1蛋白在整个进化过程中高度保守[5]，它参与了线粒体中正常蛋白质的折叠、异常蛋白质的降解和DNA的维护。近年来许多研究表明，LONP1蛋白可受到多种刺激的诱导并提供针对细胞应激的保护。LONP1蛋白的上调与下调与多种疾病的发生与发展密切相关。本文将对LONP1蛋白的结构和功能及其在常见恶性肿瘤中的表达和作用进行综述。

1 LONP1蛋白的结构

LONP1蛋白是由LONP1基因所编码的腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）依赖蛋白，该蛋白位于人19号染色体上，是“与多种细胞活动相关的ATP酶”超家族的重要成员[6]。成熟的LONP1蛋白位于线粒体基质内，占蛋白总量的90%；剩余10%为未成熟的蛋白，它们与线粒体内膜镶嵌[7]。LONP1蛋白由细胞质基质穿过线粒体双层膜结构进入线粒体基质需要线粒体靶向序列（mitochondrial targeting sequence，MTS）引导，该序列在细胞质基质与LONP1蛋白结合，引导其进入线粒体基质。当LONP1蛋白修饰成熟后，MTS被从蛋白上剪切，此时LONP1蛋白的相对分子质量由106 000减至100 000[8]。

LONP1蛋白在细菌和人线粒体中形成六聚体结构，这种结构在Mg2+存在时形成倾向较为强烈，但不因Mg2+的缺乏而崩解。此外，这种中心空腔的六聚体结构的形成与ATP无关[9]。在酵母菌等真菌中，LONP1蛋白呈现环状七聚体结构，这种结构在无ATP存在时会变形扭曲，这可能与LONP1蛋白的水解活性及分子伴侣功能有关，具体机制尚不清楚[10]。

LONP1蛋白内部由3个结构域组成：①N端结构域：N端结构域占LONP1蛋白全长的33%左右，此区域参与底物的特异性识别和结合；②ATP酶结构域：此结构又由两个子结构组成：一是较大的α/β亚结构域，此部分是与ATP结合部位，二是α结构域，其功能与ATP的水解有关；③P结构域：也称蛋白酶结构域，此区域由150～200个氨基酸组成，是一个具有蛋白水解活性的高度保守区域[11]。

2 LONP1蛋白的功能

LONP1蛋白的高度保守性几乎在所有的真核和原核生物中都有所体现[5]，其同源物在大肠杆菌、酵母菌、人线粒体内多次被发现。这从一定程度上表明，LONP1蛋白的存在对于线粒体质量的调控、维持细胞存活及生命能量供应上有一定作用，其上调与下调牵动着各个生命活动的完成。有研究发现[12]，LONP1基因缺失的纯合子（LONP1 -/-）小鼠，在胚胎时期即发生死亡；而LONP1基因杂合子（LONP1 +/-）的小鼠则可以正常生长发育。

2.1 LONP1蛋白作为蛋白水解酶

LONP1蛋白功能之一是作为蛋白水解酶的水解活性，它可以降解异常或损伤的蛋白质。氧化乌头酸酶无法参与三羧酸循环，但它属于LONP1蛋白的一种作用底物，可被LONP1蛋白降解[13]。轻度氧化的乌头酸酶可被LONP1蛋白选择性识别并降解，而过度氧化的乌头酸酶却不能被降解[14]。利用反义寡聚喹啉处理人肺纤维细胞后，细胞内LONP1蛋白水平表达下降，从而导致了氧化的乌头酸酶的积累[15]。

LONP1蛋白或参与类固醇激素合成的调控。类固醇激素急性合成调剂蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）是LONP1蛋白的底物之一，参与胆固醇由线粒体外膜向基质的转运，进入基质后的StAR蛋白被快速降解。但StAR蛋白仅在LONP1阴性突变细胞中稳定存在，当此类细胞中存在LONP1蛋白表达后，StAR蛋白依然会被降解[16]。

LONP1蛋白的水解活性也参与低氧状态下环氧化酶（cyclooxygenase，COX）全酶的重新组装。细胞色素c氧化酶亚基Ⅳ同工型1（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ isoform 1，COX4-1）在哺乳动物中表达广泛；而另一亚型，即细胞色素c氧化酶亚基Ⅳ同工型2（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ isoform 2，COX4-2）仅在如肝脏等少数组织中表达。两亚型均受氧分压的调节，在正常氧分压状态下，COX4-1在全酶中稳定表达存在。当细胞处于缺氧状态时，缺氧诱导因子α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）促进COX4-2及LONP1的表达，LONP1的上调促进了COX4-1的水解并加速了COX4-2组装入全酶，进而改变了全酶亚型的构成比[17]。

2.2 LONP1蛋白作用于线粒体DNA

大肠杆菌的LONP1蛋白可与其DNA双链结合，尤其是对富含胸腺嘧啶（thymine，T）及鸟嘌呤（guanine，G）的DNA双链亲和力较高。人线粒体DNA中含有与大肠杆菌LONP1结合位点相似的序列，这种序列在线粒体DNA重链和轻链上均存在。然而，人LONP1蛋白只选择性的结合于单链线粒体DNA的特定序列上，对于其互补链无亲和力[18]。LONP1蛋白不仅可参与线粒体DNA的生成过程[19]，也可通过参与线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）的降解而影响DNA转录[20]。

LONP1蛋白不仅可与富含T、G序列的单链DNA结合，也可结合于T、G序列含量高的核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）。ATP和蛋白质底物可以调节LONP1与核酸结合的亲和力，当ATP含量丰富时，LONP与DNA或RNA的结合力下降；当蛋白质底物含量增多时，LONP与DNA的结合力可上升约3.5倍[19]。

2.3 LONP1蛋白作为伴侣蛋白

LONP1蛋白也有分子伴侣的功能，它参与酵母菌等真菌及人线粒体内蛋白复合体的组装，且其作用与它的水解酶活性无关[21]。在低氧状态下COX全酶的组装中，LONP1蛋白被HIF-1α激活后促进了COX4-1的水解和COX4-2在全酶内的组装[17]，体现了LONP1蛋白作为水解酶和分子伴侣的双重性质。线粒体热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）对于促进线粒体前体的折叠反应至关重要，LONP1蛋白可与其协同，以稳定线粒体内膜蛋白的折叠中间体[22]。

3 LONP1蛋白与癌症

近年来许多研究显示，LONP1蛋白在维持肿瘤细胞存活中发挥了一定作用。首先，LONP1蛋白为肿瘤细胞在低氧状态下创造生存条件。癌症的特点之一为肿瘤细胞大量增殖，而这种增殖使癌细胞有两个特点，一是细胞内为低氧微环境，二是肿瘤细胞更偏向于利用糖酵解供能。在低氧状态下，LONP1蛋白可通过COX全酶的重组来提高细胞的呼吸效率[17]。其次，LONP1蛋白作为水解酶，可以降解异常或损伤的蛋白，维持肿瘤细胞线粒体的稳定[23]。LONP1蛋白可被蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）磷酸化，磷酸化后的LONP1蛋白水解活性增强[24]，有利于肿瘤细胞的存活与增殖。有许多研究表明，LONP1表达上调可影响癌细胞上皮间质转化过程，促进肿瘤的侵袭及转移[25-27]，这个过程可经由核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路来实现[28]。最后，LONP1蛋白在结肠癌、膀胱癌等多种癌细胞中的高度表达也激发了人们对于LONP1与更多癌症关系的探究，这提示一些恶性肿瘤的诊断及治疗可从LONP1基因及其蛋白本身入手。

3.1 LONP1蛋白与大肠癌

目前大肠癌的发病机制尚未完全清楚，可能与癌症发展中首先形成的息肉的基因突变有关[29]。有研究[12]在LONP1杂合子（LONP1 +/-）和LONP1纯合子（LONP1 +/+）小鼠中诱导结肠癌形成，结果发现，所有的LONP1纯合子小鼠都罹患结肠癌，而仅有72%的杂合子小鼠罹患结肠癌。此外，在所有患有结肠癌的小鼠中，杂合子小鼠的临床表现比纯合子小鼠更轻。进一步比较不同人类结肠癌细胞系以及结肠上皮细胞系中LONP1蛋白的表达水平，发现LONP1蛋白在所有结肠癌细胞系中均高度表达，推测LONP1蛋白的上调促进结肠癌的发生与发展。

Gibellini等[30]在不同来源的癌细胞中检测了LONP1蛋白的表达程度，除结肠癌细胞之外，LONP1蛋白也在另外多种癌细胞中表达上调；而在正常细胞中，LONP1蛋白处于低表达水平。沉默结肠癌细胞中的LONP1蛋白，线粒体功能下降，表现为线粒体DNA及TFAM的表达减少。此外，伴随着LONP1蛋白下调，癌细胞的线粒体出现大小和形状不一的情况，其内出现空泡和包裹体，这均与未成熟蛋白质的积聚有关。而在结肠癌细胞中上调LONP1蛋白表达，LONP1高表达伴随着N-钙黏蛋白（N-cadherin，NCAD）的表达增加和E-钙黏蛋白（E-cadherin，ECAD）的表达降低，从而促进了上皮间质转化过程。但在转移性结肠癌细胞中上调LONP1蛋白表达，ECAD蛋白表达量增加，而NCAD蛋白表达量无明显变化。进一步收集大肠癌患者的癌组织标本发现，在具有人体抑癌基因p53突变或核β-连环蛋白（beta-catenin，β-ctn）突变的样品中，LONP1蛋白表达量较正常组织增多[25]。

金冬林等[31]研究了LONP1蛋白在结肠癌中的表达及其对癌症分期和预后的影响。同先前Gibellini的研究结果相同，结肠癌组织中的LONP1蛋白表达率远远高于癌旁组织。在不同的癌症分期中，LONP1蛋白的表达水平也有所差异。对术后患者随访，结果示高LONP1蛋白表达者的生存率和总生存期数值均小于低表达患者。

3.2 LONP1蛋白与膀胱癌

Liu等[32]测定了多种膀胱癌细胞系中LONP1蛋白的表达情况，LONP1蛋白在正常膀胱细胞中表达很低，但在癌细胞中高度表达。敲除LONP1基因，癌细胞的增殖被抑制，同时细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成减少、磷酸化的c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）减少。这表明LONP1蛋白或通过ROS诱导的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号途径下调JNK磷酸化而抑制肿瘤细胞增殖。在临床方面，LONP1蛋白表达量与癌组织分化程度密切相关，分化程度越高的癌组织LONP1蛋白表达越低。对于患者来说，LONP1蛋白低表达者的总生存率显著高于高表达患者。

在维持膀胱癌细胞生存的过程中，LONP1不仅可以独自发挥作用，而且可与其他蛋白联合，协同保护癌细胞线粒体功能。分别敲除膀胱癌细胞中的LONP1及酪蛋白水解酞酶（caseinolytic protease，ClpP）基因，癌细胞生长均受到抑制。但同时敲除LONP1和ClpP基因，会比单次敲除导致更多的癌细胞死亡。同样，在体内，这两种蛋白均高度表达的前列腺癌患者，比仅有其中一种蛋白高水平表达的患者有更短的生存期[33]。

3.3 LONP1蛋白与宫颈癌

人宫颈鳞癌细胞SiHa中的LONP1蛋白表达水平高于正常细胞。下调SiHa细胞中LONP1蛋白表达后，细胞的增殖活性、抗凋亡能力及迁徙性都有所下降，表现为活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-3）的增多及B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，bcl-2）的减少[34]。

而在宫颈癌HeLa细胞中，LONP1蛋白的表达变化对于细胞的影响不明显，蛋白表达水平变化不会引起细胞自噬和线粒体活性变化。但蛋白下调会引起HeLa细胞线粒体内产更多ROS，使细胞内氧化受损的蛋白质增多并积累，最终抑制20 s蛋白酶体的活性[35]。

3.4 LONP1蛋白与其他肿瘤

LONP1蛋白在肝癌细胞中高度表达，其表达程度与肿瘤的临床分期有关，分期越晚蛋白表达水平越高。在对肝癌患者的随访中发现，LONP1蛋白表达越低的患者具有越长的生存期和更好的预后[36]。薛霞等[37]在人乳腺癌细胞中下调LONP1蛋白表达，癌细胞增殖被抑制，少数细胞凋亡。进一步用紫杉醇、顺铂等药物处理蛋白下调的癌细胞，得到同样结果。幽门螺旋杆菌（helicobacter pylori，Hp）可反复破坏胃黏膜引起胃炎和胃溃疡，进而使患者罹患胃癌几率显著增加。在被Hp感染的胃上皮细胞中，LONP1蛋白表达增多，这种增多通过HIF-1α来直接调节[38]。

LONP1蛋白在肺成纤维细胞等正常肺组织细胞中处于低含量状态，相反，它在肺非小细胞癌细胞中含量丰富。下调肺癌细胞中LONP1蛋白表达，发现活性caspase-3蛋白表达增多，并伴随着肺癌细胞凋亡数量增多[39]。而LONP1蛋白过度表达则会使非小细胞肺癌细胞对抗细胞凋亡，增加癌细胞的生存优势[40]。在胰腺癌中，与癌旁组织相比，LONP1蛋白在胰腺癌组织中表达上升。在胰腺癌细胞中下调LONP1蛋白表达，癌细胞的细胞增殖活力、迁徙能力及侵袭能力均受到抑制[27]。在神经胶质瘤细胞中，敲除LONP1基因后，癌细胞的活力及对缺氧的适应能力均显著降低。应用LONP1抑制剂不仅可有效抑制癌细胞增殖，还可增强如替莫唑胺等化疗药物对神经胶质瘤的治疗效果[41]。

4 结语与展望

综上所述，LONP1在多种肿瘤细胞中表达上调，敲除或过表达LONP1基因均会影响癌细胞的增殖及迁徙。这种关系扩展到临床方面即表现为LONP1的表达量与患者预后及生存期之间的关系，现有研究证实，在多种肿瘤中LONP1表达量与患者生存期呈现负相关关系。

LONP1蛋白作为存在于线粒体内的蛋白酶，在维持线粒体稳态方面起到重要作用，虽然众多研究已证实LONP1蛋白在多种恶性肿瘤中高表达，但对于其作用机制缺乏深入研究。此外，LONP1的抑制剂是否可与放疗或化疗药物联合应用提高肿瘤的治疗效果也尚未明确。LONP1作为近年来肿瘤靶向治疗的新热点，对以上问题的继续探讨，可能对临床上判断肿瘤预后，进一步增加肿瘤治疗手段，并提高癌症的治疗效果提供帮助。