TRPC3与心血管疾病的研究进展

胡国庆，李学文

典型瞬时受体电位通道(TRPCs)是一系列具有不同Ca2+选择性的非选择性阳离子通道，支持钙离子在许多器官中的渗透，包括心脏、大脑和肾脏。本研究将对其与心血管病的关系及治疗进展进行综述。

1 TRPC3的分子结构

TRPCs由TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6和TRPC7共7个哺乳动物型成员组成，基于序列相似性和功能分析，被进一步分为3组：TRPC1、TRPC4、TRPC5由Gαq偶联受体和受体酪氨酸激酶激活，而TRPC3、TRPC6、TRPC7由二酰基甘油(DAG)激活，TRPC2是一个假基因[1]。在人体组织中，TRPCs通常为G蛋白偶联受体下游的信号转导通路服务，与所有其他TRPC通道一样，TRPC3具有6个跨膜段，氮(N)和碳(C)末端位于细胞质中[2]。Fan等[3]用单粒子冷冻电子显微镜观察了处于脂质占据的非活性状态的全长人TRPC3(hTRPC3)的结构，TRPC3组装成四聚体复合体，其中细胞质末端相互作用形成一个倒钟形的细胞质层。四聚体组装构成了一个阳离子渗透路径，即带负电荷残基的选择性过滤器(848aa变体中的E630；UniProt中的异构体3/Q13507-3)，从而确定孔域内Ca2+的运输，连接跨膜域5和6(TM5和TM6)。多个细胞质调节域已被鉴定，包括C-端高度保守的富含脯氨酸和钙调蛋白/IP3受体结合(CIRB)区域，使该通道能够发挥多模式信号功能[4]。最初，该通道被发现与钙池操纵的Ca2+内流(store-operated Ca2+entry，SOCE)有关。Lichtenegger等[5]采用由结构导向诱变和脂质光药理学组成的方法证明，TRPC3的脂质信号传导涉及1个位于通道孔域的侧开孔，通过容纳脂质介质来控制门控，与DAG敏感的亲属TRPC6和TRPC7一样，TRPC3与一系列病理和疾病相关，包括肿瘤、神经退行性疾病、心肌肥大、高血压、心律失常等。

2 TRPC3的功能

2.1 TRPC3与心肌肥大 心肌肥大是导致心源性死亡的最重要的病理基础，研究表明，TRPCs通过介导离子通道活性和下游信号在心肌肥大的病理过程中发挥重要作用。Nakayama等[6-7]运用基因测序、基因敲除、蛋白质印迹等方法证明，在TRPC3转基因小鼠的生长过程中，随着小鼠年龄的增长，其左心室明显扩张，并且通过测量发现其射血分数降低。当TRPC3压力过载或TRPC3基因过度表达可引起心肌病理性肥大，从而得出心脏中TRPC3的过度表达通常会导致心肌病。Wu等[8]研究证明，TRPC3通道是病理性心肌肥大的必要介质，蛋白激酶G(PKG)是一氧化氮(NO)或心钠素环磷酸鸟苷(cGMP)信号通路的下游靶点，每条通路都对心肌肥大负性调节；在TRPC6的T11和S263、28、T70和S322位点上，TRPC3可被PKG直接磷酸化，TRPC3是心脏微域信号的关键调节者，通过钙调神经磷酸酶和活化T细胞的核因子(NFAT)等效应器来协调信号传导，从而控制病理性肥大，通过进一步实验证实，运用Pyr3可以选择性抑制与压力超负荷相关的病理性心肌肥大。Ma等[9]通过高盐处理增加了心肌细胞中线粒体TRPC3的表达，并伴随着线粒体钙摄取的增加和活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生的增多，抑制TRPC3会显著减少高盐诱导的ROS产生，通过刺激氧化磷酸化促进ATP产生，并增加心肌细胞线粒体中的酶活性；此外，TRPC3缺乏可以抑制体内高盐诱导的心肌肥厚，他们认为，长期高盐饮食导致了心脏线粒体TRPC3的表达，增加了心脏肥大标志物心房钠尿肽(ANP)、脑钠尿肽(BNP)和b-肌球蛋白重链(b-MHC)的表达，并降低了ATP的产生和线粒体复合体Ⅰ和Ⅱ酶活性，TRPC3缺乏通过改善TRPC3介导的心肌线粒体功能障碍对抗高盐饮食介导的心肌肥厚，因此，TRPC3可能是预防高盐诱导的心脏损伤的新靶点。Bandleon等[10]发现FK506结合蛋白52(FKBP52)是TRPC3在心脏中的一种新的相互作用蛋白，FKBP52通过TRPC3碳末端的一个尚未描述的结合位点与TRPC3结合，并以肽基-脯氨酰顺/反异构酶依赖的方式调节TRPC3依赖的Ca2+信号，二者呈负相关，并认为二者的相互作用对于限制慢性心肌肥大刺激期间TRPC3依赖的信号传导起着重要作用。

2.2 TRPC3与高血压 血管平滑肌细胞(vascular smooth musclecells，VSMCs)通过调节血管直径和血流来充当血压的关键因素。离子通道启动并调节收缩和VSMC张力，调节细胞内Ca2+水平。L型电压依赖性钙通道(LTCC)是血管平滑肌细胞Ca2+内流的主要途径，而非选择性阳离子通道也被认为是调节血管张力的重要角色，它调节膜电位或提供独立于LTCC激活的Ca2+进入途径。TRPC家族属于血管平滑肌细胞表达的非选择性阳离子通道家族，被认为是受体-操作通道(ROC)和拉伸-操作通道(SOCs)的分子组成部分其将DAG信号级联途径与LTCC激活联系起来[11]。Liu等[12]通过免疫组化、基因敲除、蛋白质印迹的方法研究表明，高血压病人以及压力超负荷大鼠和自发性高血压大鼠模型中TRPC3水平升高。在自发性高血压大鼠模型中，DAG和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的Ca2+内流在其病理状态下升高。进一步研究表明，通过siRNA下调TRPC3，或应用高选择性TRPC3抑制剂吡唑-3(Pyr3)，减少了DAG和AngⅡ诱导的SHR单核细胞Ca2+内流[12-13]。TRPCs改变细胞内Ca2+的分子机制被认为是AngⅡ和血管内皮素(PE)刺激GPCRs，通过PIP2释放DAG和IP3，随后激活PLC。DAG刺激ROCs，包括TRPC3和TRPC6，导致细胞外Ca2+内流。IP3通过SR/ER中的Ca2+释放，随后激活的TRPCs激活SOCE以应对细胞内Ca2+储存的耗竭。持续TRPC介导的Ca2+进入从而直接激活钙调神经磷酸酶NFAT通路，进而激活包括TRPC1、TRPC3和TRPC6在内的基因表达[14]。以上研究均表明TRPC3与高血压的发生呈正相关。

2.3 TRPC3与心律失常 心律失常是一组心脏电活动不规律的情况，有超过100次/min的快速型心律失常、也有低于60次/min的缓慢型心律失常。TRPC家族广泛存在于心房和心室，在心脏电活动中调节心脏起搏、传导、心室活动和收缩力。Harada等[15]发现心房颤动(AF)时通过激活活化T细胞核因子介导的microRNA-26的下调，从而增加了TRPC3的表达，此外，AF诱导了成纤维细胞增殖和分化过程中对于TRPC3的依赖，可能是通过介导Ca2+进入来刺激细胞外信号调节激酶信号。TRPC3阻断剂可在持续AF的狗模型中阻止AF基质的形成。Duzen等[16]通过对比47例非瓣膜病心房颤动病人和47例性别、年龄相匹配的窦性心律对照组的mRNA，发现对照组中的TRP通道表达水平较低，证明TRP通道的基因表达升高与非瓣膜病心房颤动的发病机制有关。

2.4 TRPC3与心力衰竭 心力衰竭是指由于心脏的收缩功能和(或)舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍的症候群。目前认为，由于细胞外基质蛋白沉积引起的间质纤维化导致的心脏僵硬，是射血分数保留的心力衰竭的主要临床结果。ROS是由线粒体呼吸链的缺陷和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶(Nox)的激活而产生的。在大多数心脏病理生理条件下，ROS的产生会加剧心脏重构和功能障碍。TRPC3介导Ca2+内流激活了蛋白激酶C(PKC)，PKC磷酸化p47phox(存在于胞质中的亚基，主要调控Nox2复合物的形成)，引起Nox2酶的激活。TRPC3不仅可调控Ca2+通道，还有蛋白质稳定剂的作用，TRPC3可阻止Nox2的蛋白酶体稳定性下降，二者的相互正调控使应激心脏的ROS生成异常增加，导致心肌细胞和心肌成纤维细胞RhoA途径激活，最终导致心脏纤维化[17]。第二信使环磷酸腺苷(cAMP)在调节心肌细胞存活和死亡中起关键作用。cAMP可以通过刺激与不同膜相关腺苷酸环化酶偶联的各种G蛋白偶联受体产生，碳酸氢盐直接刺激可溶性腺苷酸亦可产生。不同的环核苷酸磷酸二酯酶可以催化环磷酸腺苷的降解。不同来源的cAMP在心肌细胞中具有不同或相反的功能。例如，β1肾上腺素能受体(β1-AR)衍生的环磷酸腺苷促进心肌细胞死亡，而腺苷2型受体(A2R)衍生的环磷酸腺苷则相反。PDE是一个酶的超家族，PDE1代表人类心肌中最高的PDE活性，PDE1C在病理性心脏重塑中如心肌肥大、心肌纤维化等起致病作用[18]。Zhang等[19]证明TRPC3来源的Ca2+激活PDE1C对心脏保护性A2R来源的cAMP信号产生负调节作用。G蛋白偶联受体信号由b-arrestins负调节，b-arrestins是衔接分子，也激活不同的细胞内信号通路。Liu等[20]揭示了TRV120027，一种血管紧张素Ⅱ受体1型(AT1R)的b-arrestin-1偏向激动剂，通过与瞬时受体电位阳离子通道亚家族C3(TRPC3)偶联刺激急性儿茶酚胺分泌，证明长期抑制肾上腺b-arrestin-1功能将有助于某些病理条件下心力衰竭的治疗。以上表明，TRPC3在心脏重构的发展中起着关键作用。

3 TRPC3与心血管疾病的治疗

早期识别和表述TRPC3通道功能的试验是基于非特异性通道阻滞剂，常用的受体介导的Ca2+内流的非选择性抑制剂维拉帕米或SKF96365，由于其靶位范围广，这些阻断剂仅有限地用于天然组织中TRPC3的研究，不适用于治疗应用的开发。Kiyonaka等[21]合成并表征了一系列吡唑衍生物，形成一种新的吡唑3(Pyr 3)TRPC通道抑制剂，对TRPC3有明显的靶向性，此后被广泛应用于各项实验。Schleifer等[22]鉴定了其他吡唑衍生物，包括选择性TRPC3阻断剂(Pyr10)，而其另一项筛选研究确定了两种有效且选择性的TRPC通道噻唑抑制剂，这些化合物被命名为GSK2332255B(GSK255B)和GSK2833503A(GSK503A)，即苯胺基噻唑。Seo等[23]在心脏肥大和重塑的动物模型中对GSK255B和GSK503A进行了测试，这两种新开发的选择性TRPC3/6双阻滞剂对AngⅡ、内皮素-1和PE激活的心肌细胞肥大信号具有明显的抑制作用，在HEK293T细胞以及在新生儿和成人心肌细胞中这种现象呈剂量依赖性。其他的TRPC3阻断剂，如去甲孕酯、HC-C3A等，选择性尚不明确[24]。目前，对TRPC3合成激活剂的相关研究有限，因大多数TRPC3相关病理与表型的表达增强或功能增强有关。因此，药物开发活动主要集中在通道的选择性拮抗剂或阻断剂上。现出现一种高空间精度干预的非常规方法称为光药理学，偶氮苯是一种构象柔性的光敏结构，其位于DAG的脂族侧链中，结构和活性由光可逆地控制，这使其成功应用于研究TRPC细胞特异性功能以及配体-蛋白质相互作用和通道激活-失活动力学的工具中，光药理学的发展能够为TRPC3的研究提供新手段，可能为临床心血管疾病的治疗提供新思路、新方法[25-26]。

4 小 结

由TRPC3通道介导的心脏重塑的病理机制仍有待充分探索，特别是关于SOCE和ROCE过程。由于一系列下游TRPC3信号机制，Ca2+超载可引起许多病理后果。对TRPC3结构认识的加深会进一步提高对心血管疾病病理过程的认识，光药理学的发展则为未来的临床应用提供更多可能。众多研究表明，TRPC3可能是一个理想的治疗心血管疾病的靶点，对TRPC3信号通路的进一步探索以及对其如何调节促纤维化因子的激活和产生的进一步理解，将有助于心血管疾病靶向治疗的发展。