黏膜免疫系统及适于其接种的疫苗佐剂传递系统

王 丹，王 宁，王 汀*

（1.安徽医科大学 药学院，安徽 合肥 230032；2.合肥工业大学 食品与生物工程学院，安徽 合肥 230009）

人类及哺乳动物的呼吸道、消化道、泌尿生殖道及眼腔的黏膜组织为宿主与外部环境之间的相互作用及物质交换提供了界面，同时这些黏膜组织也是人体最大器官之一，总面积超过 400 m2。其中免疫系统所形成的先天免疫和获得性免疫发挥着维持机体免疫稳态等重要作用[1]。由于持续暴露于外部环境且具有很大的表面积，黏膜是许多病原体入侵机体的主要途径。为了防止病原体入侵，宿主黏膜配备了多重物理和生物屏障，包括形成紧密连接蛋白、粘蛋白、致密牢固连接的上皮细胞[2]，以及生成某些抗菌肽，如上皮细胞产生的防御素等。此外，黏膜组织中含有大量的先天性及适应性免疫细胞，它们被抗原激活后能够分泌免疫球蛋白 A（secretory immunoglobulin A，SIgA）至粘膜表面，形成第一道免疫防御系统。

近年来，人们在免疫学研究领域取得了丰硕的成果，为我们了解复杂的粘膜免疫系统提供了帮助。研究发现，通过黏膜部位接种疫苗诱导的免疫反应，可以形成局部甚至全身的黏膜免疫，从而发挥全面的保护作用。相比之下，注射入其它组织或血液中的常规疫苗却难以提供这种广泛的保护作用[3]。因此，人们越来越意识到开发可以通过黏膜途径接种的疫苗的重要性。然而，由于我们对黏膜免疫的了解非常有限，因此黏膜疫苗的研究与开发仍然面临较大的困难和挑战。在此，我们先以肠黏膜为例介绍黏膜免疫系统的独有特征，随后介绍适用于黏膜免疫系统的疫苗佐剂-传递系统。

1 黏膜免疫系统的独有特征

在感染过程中，黏膜免疫系统通过对入侵的病原体和疫苗接种过程中传递的抗原做出反应来协调机体先天性免疫反应和适应性免疫反应。宿主黏膜相关组织是许多内源性微生物的滋生场所。这些微生物之所以可以与宿主无害共存，主要是由于黏膜免疫系统的调控作用始终维持着宿主与寄生微生物间的共生平衡[4]，同时二者相互协作共同抵御有害病原体的不速入侵。黏膜免疫系统从功能上分为两个主要部分：一部分为抗原诱导免疫反应的起始位点。主要是黏膜相关淋巴组织（mucosa-associated lymphoid tissues，MALTs），包括肠相关淋巴组织、呼吸道相关淋巴组织和眼结膜相关淋巴组织或微褶细胞（microfold cell，M 细胞）等具有生发中心的上皮淋巴组织；另一部分为黏膜免疫反应的效应位点。主要参与抗体的产生和细胞介导的免疫反应，包括肠道、呼吸道、生殖道等黏膜固有层（lamina propria，LP）、乳腺和泪腺等一些腺体组织[5]。抗原刺激激活的免疫细胞不断地从诱导位点迁移到效应位点，形成黏膜免疫系统（common mucosal immune system，CMIS）的细胞基础[6]。黏膜免疫系统缺乏传入淋巴系统，但具有独特的抗原采样系统，例如位于 MALTs 上皮层的 M 细胞。

此外，MALTs 还包含产生抗原特异性免疫反应所需的其它免疫细胞，如树突状细胞（dendritic cell，DC）、巨噬细胞、T 细胞和 B 细胞。抗原被 M 细胞摄取后呈递给抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC），如 DC，将抗原加工成肽并以抗原肽-主要组织相容复合物（major histocompatibility complex，MHC）形式转运至下层 T 细胞区[7]。在 T 细胞区中，抗原肽被呈递给原始 T 细胞，后者被激活形成抗原特异性 T 细胞，包括 Th1、Th2、Th17 和细胞毒性 T 细胞。抗原特异性 T 细胞诱导生发中心 B 发生免疫球蛋白 A（immunoglobulin A，IgA）类转换重组以及 B 细胞成体超突变（somatic hypermutation）[8]。细胞分子间的相互作用，例如CD40/CD40L 配体的相互作用，以及与 IgA 表达相关的细胞因子，如转化生长因子（transforming growth factor，TGF）、白介素（Interleukin，IL）IL-2、IL-4、IL-5、IL-6 和 IL-10，在 T 细胞辅助 B 细胞激活过程中也可发挥重要作用，协同诱导产生 IgA-表达型 B 细胞分化成为浆细胞[9]。

在 IgA 类转换和亲和力形成后，IgA-表达型 B 细胞（IgA+B细胞）从诱导位点，如 Peyer 氏结（Peyer’s patches，PPs），鼻咽相关淋巴样组织（nasopharynx-associated lymphoid tissue，NALT）通过传出淋巴管迁移至该区域淋巴结。在抗原特异性 CD4+T 细胞及 Th2 型细胞因子（如 IL-5 和IL-6）的影响下，最终分化为浆细胞，浆细胞分泌 IgA 抗体，该抗体以二聚体形式通过与位于黏膜上皮细胞中的基底外侧聚合 Ig 受体（polymeric Ig receptors，pIgRs）结合为 2IgA-pIgR 复合物而被上皮细胞内吞，再被转运至顶端表面，然后裂解释放至黏膜表面黏液中，形成分泌型 IgA（SIgA）[10]。

1.1 肠黏膜相关淋巴组织是黏膜免疫的“指挥中心”

肠道相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissues，GALT）上的主要诱导位点包括组织化的淋巴滤泡，如 PPs、阑尾和孤立的淋巴滤泡（isolated lymphoid follicle，ILF）。其中，PPs 是研究最广泛的黏膜诱导组织，被认为是胃肠道免疫系统中最大的有组织淋巴样组织之一。PPs 的发育是从胚胎发育过程开始的，在胚胎小鼠中，血管细胞粘附分子 1 和细胞间粘附分子 1 在肠道基质细胞（被称为 PP 组织细胞）上的表达，是启动 PP 形成的信号[11]。该信号出现后立即出现PP 诱导细胞，它是淋巴组织诱导细胞的组成部分，具有独特的细胞表面标志物模式：IL-7R+CD3-CD4+CD45+。PP 诱导细胞在基质细胞上表达淋巴毒素-α和淋巴毒素-β，它们形成异三聚体并与淋巴毒素-β受体（肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）家族的成员）相互作用，以提供下一波信号来诱导 PP 的组织。研究发现缺乏淋巴毒素-α，淋巴毒素-β或淋巴毒素-β受体的小鼠也缺乏 PP，这证明了这些因素在 PP 器官发育中的重要性[12]，且 IL-7R 或淋巴毒素-β受体信号传导在妊娠期间被阻断，也会导致 PP 的选择性丢失。

另外，诱导剂和组织细胞之间通过趋化因子和细胞因子受体的相互作用是 PP 形成的关键。在这个过程中组织细胞产生 CXC 趋化因子配体 13（CXC chemokine ligand 13，CXCL13）和趋化因子配体 19（CC chemokine ligand 19，CCL19），它们通过 CXC 趋化因子受体 5（CXC chemokine receptor 5，CXCR5）和趋化因子受体 7（CC chemokine receptor 7，CCR7）刺激 PP 诱导细胞。此外，淋巴组织诱导细胞表达 DNA 结合抑制剂 2（inhibitor of DNA binding 2，Id2）和与视黄酸受体相关的孤儿受体γ（retinoic-acid-receptor-related orphan receptor-γ，RORγt）的关键转录因子，这些分子的基因缺失导致 PPs 和外周淋巴结的缺失[13]。PP 是大多数 IgA 免疫反应开始的主要诱导位点，在稳态条件下，PPs 中会出现生发中心，这些中心为 B 细胞从 IgM 到 IgA的类别转换创造了分子和细胞环境。因此，就像外周免疫系统的淋巴结和脾脏一样，GALT 将抗原和免疫细胞聚集在一起，以启动抗原特异性免疫反应，使其成为黏膜免疫系统的“指挥中心”。

1.2 NALT 的发生与功能

NALT 是上呼吸道的关键二级淋巴结构，肠道 PP 和 NALT 之间的主要区别在于它们的发生和发育过程。PP 的形成是从胚胎开始的，而 NALT 的形成是在出生后开始的。淋巴毒素-α1β2与淋巴毒素-β受体的相互作用是 PP 形成的最重要步骤，而 NALT 的形成似乎独立于该分子信号传导：在淋巴毒素-α缺陷小鼠和淋巴毒素-β受体缺陷小鼠中均已观察到 NALT 结构[14]。与PP 发育相反的是缺乏核因子 κB 诱导激酶（淋巴毒素 B 受体下游的信号分子）不影响 NALT 的发育。在 IL-7Rα、RORγt、CCL13、CCL19 和 CCL21 缺陷小鼠中也观察到正常的 NALT 发育，但所有小鼠均显示 PP 发育受阻或受损[15]。因此，NALT 器官发生的独特性可能源于这些独特的诱导细胞。

就像 PP 引发的抗原特异性免疫反应在胃肠道中传递保护性免疫一样，NALT 引发的免疫反应在呼吸道中也提供抗原特异性保护。除在呼吸道之外，鼻腔免疫还可以在唾液腺和生殖系统中诱导抗原特异性黏膜免疫反应，鼻黏膜霍乱毒素 B 亚基（cholera enterotoxin B subunit，CTB）抗原免疫在人的阴道和子宫颈中诱导 CTB 特异性 IgA 反应[16]。因此，NALT 被认为是递送疫苗抗原的诱人位点，以便其在口腔和生殖组织中（除呼吸道之外）诱导抗原特异性免疫。

1.3 泪道相关淋巴组织器官的发生和功能

眼泪是抵抗外源抗原的第一道防线，并含有炎性细胞因子（例如 IL-1、IL-6、IL-8 和 TGF-β，抗微生物防御肽）和 SIgA[17]，在提供黏膜先天性和后天免疫力方面起着重要作用。直接桥接眼腔和鼻腔的泪管起源于淋巴组织，称为泪管相关淋巴样组织（tear duct-associated lymphoid tissue，TALT），TALT 可诱导和调节针对眼表沉积抗原的抗原特异性免疫反应。在小鼠中，TALT 像NALT 一样在出生后开始生成，但不同于 PPs，TALT 在缺乏 B 细胞或 T 细胞的小鼠和无菌小鼠中产生，这表明 B 和 T 淋巴细胞以及微生物刺激对于小鼠 TALT 的发展是可有可无的[18]，而且 TALT 的产生独立于 Id2、RORγt 和淋巴毒素介导的信号传导级联反应，所有这些都参与了其他淋巴组织的发育，例如 NALT、淋巴结和 PPs。

位于 TALT 上皮中的 M 细胞可以吸收眼部遇到的抗原，进而诱导抗原特异性免疫反应。研究发现，用霍乱毒素（cholera toxin，CT）进行眼部免疫不仅会诱导 TALT 中 IgA+B 细胞反应和抗原特异性 Th 细胞的生发中心的形成，而且还会诱导 NALT 中抗原特异性 B 和 T 细胞反应的形成，沉积在眼睛中的抗原最有可能通过眼腔和鼻腔之间的泪管桥到达 NALT 上皮。相反，用微囊化抗原进行鼻腔免疫会引发眼部免疫反应，例如在泪腺中诱导产生抗原特异性泪液 IgA 抗体和分泌抗体的细胞[19]。

2 菌群在黏膜免疫系统发育中的作用

黏膜表面的特征是宿主-微生物相互作用。微生物群的组成也称为共生生物，由数百种物种组成，可通过提供营养、代谢原本不易消化的食物，以及防止有害病原体定植来使宿主受益。无菌条件下，对在隔离器中繁殖并保持无菌状态的无菌动物的研究，强调了肠道菌群对于黏膜免疫系统中次级淋巴结构发育的重要性[20]。多项研究表明，无菌动物在 GALT 的发育和成熟中以及抗体产生方面表现出缺陷，包括 PP 数量减少、产生 IgA 的浆细胞减少、CD4+T 细胞的数量减少。此外，共生体还诱导了三级淋巴结构的发展，例如 ILF 和隐膜，并促进上皮细胞成熟和血管生成，从而促进了肠屏障的强化[21]。

这些发现表明，肠道菌群为肠道的发育提供了最有效的环境刺激。实际上，将细菌引入无菌小鼠体内，可以使它们的组织学和解剖学上不成熟的 PP 正常发育。无菌小鼠口服暴露于单一病原性或非病原性微生物会导致 PP 的成熟和数量的增加。同样，在无菌小鼠中口服脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或大肠杆菌单感染也加速了 PP 的免疫学功能发展[22]。这些发现表明，肠道微生物刺激可诱导产生最佳的炎症信号环境（或生理炎症），这是 GALT 免疫系统的成熟和维持所必需的。研究发现，共生细菌的细胞成分（例如 LPS）及其相关代谢产物，以及位于组织内的共生微生物，对黏膜免疫系统的形成和维持以及免疫应答的诱导和调节都提供了重要的环境[23]。

3 适用于黏膜免疫的疫苗佐剂传递系统

黏膜具有广阔的表面积，是大多数病原体进入人体的主要途径。因此，非常需要能够有效保护黏膜部位的新疫苗。当前的大多数疫苗接种方法都是针对全身免疫系统，仅能引起较弱甚至不能引起黏膜免疫反应。但用适当的疫苗递送载体进行黏膜免疫可诱导黏膜保护性免疫和全身性免疫应答，从而形成针对病原体的双重保护。另外，与肠胃外途径相比，黏膜疫苗递送具有诸如方便给药、降低成本、避免针刺伤害以及降低了血源性疾病传播风险的优点。然而，黏膜疫苗的开发一直很缓慢，仅少数黏膜疫苗被批准用于人类临床使用。在以下各节中，我们重点介绍一些有助于黏膜疫苗传递的研究成果。

3.1 突变细菌毒素型黏膜佐剂

黏膜免疫系统对遇到的绝大多数抗原有免疫耐受性，以防止过度和有害的炎症反应和食物过敏。但使得通过黏膜途径给予的抗原成为弱免疫原，阻碍黏膜疫苗的有效开发。因此，安全有效的黏膜佐剂对于实现抗原的黏膜递送是必不可少的。但是很少发现具有足够效力的黏膜佐剂不会产生毒性，可用的最有效的黏膜佐剂中，有基于毒素的佐剂，例如分别由大肠杆菌和霍乱弧菌产生的不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT）和霍乱毒素（CT）。LT 和 CT 均由一个活性 A亚基和五个结合 B 亚基组成，当其与蛋白质抗原通过口服或肠胃外途径共同给药时，可促进黏膜和全身免疫[24]。尽管 CT 和 LT 具有潜在的辅助作用，但在黏膜给药后仍会引起严重的腹泻并对神经系统构成潜在威胁。因此，为了降低 CT 和 LT 的有害酶活性，通常通过定点诱变已经产生了这些天然毒素的突变体。

CT 的两个突变体，分别称为 S16F 和 E112K，在 A 亚基的 ADP-核糖基转移酶区域中每个都包含一个氨基酸取代。这些突变体被认为是无毒的，因为它们在体外缺乏 ADP-核糖基转移酶的活性和 cAMP 的形成，因此在体内不会引起腹泻[25]。LT 的突变体 LTK63 是另一种新型有效且安全的有吸引力的佐剂候选药物。LTK63 是 LT 的 A 亚基活性位点上的一个氨基酸取代基，是 LT 的合成无毒 AB 复合突变体，类似于 CT 的 S16F 和 E112K，由于 LTK63 缺乏 ADP-核糖基转移酶活性，因此被认为是无毒的[26]。这些佐剂由于没有任何不良的生物学活性，所以很大程度上有助于黏膜疫苗接种领域的发展。

3.2 “水稻”作为黏膜疫苗递送和蛋白质表达的新型系统

基于植物的黏膜疫苗具有无需使用“冷链”、针头和注射器的独特优势。通过将细菌和病毒抗原基因引入植物表达系统，已经开发了几种基于植物的可食疫苗。这些可食疫苗的抗原包括 LT的 B 亚基、CTB 以及鼠疫耶尔森氏菌和病毒的抗原。这些抗原已被引入到胡萝卜、大豆、番茄、大米、马铃薯和烟草中[27]。我们重点介绍基于水稻的疫苗（MucoRiceTM）。

水稻种子中独特的蛋白质存储细胞器，称为蛋白质体，为表达疫苗抗原提供了一种合适的载体，不仅可以在室温下长时间稳定而不丧失免疫原性，而且还可以保护人体免受胃肠道消化酶的侵害。当用表达 CTB 的基于水稻的疫苗（名为MucoRice-CTB）对小鼠进行口服免疫时，抗原蛋白可以被 PP 上的抗原采样 M 细胞有效吸收，而不会在胃中消化[28]。使用类似于生产MucoRice-CTB的系统，我们可以生产各种治疗性抗体。例如，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）是一种有效的炎症细胞因子，水稻种子中可以产生对 TNF 具有特异性的纳米抗体，该抗体只包含一个重链可变区，可以抑制小鼠胶原诱导的关节炎的进展[29]。因此，MucoRice 系统能够作为一种产生疫苗抗原和纳米抗体有吸引力的系统，原因在于它提供了一种可以长时间保存而无需冷链的口服递送疫苗的载体。

3.3 用于无佐剂疫苗递送的纳米凝胶

气道黏膜免疫系统是开发黏膜疫苗的另一个目标，鼻内途径递送抗原以保护其免受呼吸道传染病的侵害。最早使用的先进抗流感鼻喷雾疫苗由于含有活的病原体会引起副作用[30]。与口服免疫一样，由于单独使用灭活疫苗或亚单位疫苗时，它们的免疫原性很差，因此需要与具有生物活性的黏膜佐剂共同给药。疫苗抗原与 CT 或 LT 一起进行鼻内免疫已被证明可有效地诱导保护性免疫，然而这种免疫的缺点是佐剂或抗原可能被定向至中枢神经系统引起中枢副作用[31]。因此需要开发安全、无佐剂的鼻疫苗递送系统来解决这些缺点和安全性问题。

纳米级水凝胶（nanogel）是一种新型的鼻内疫苗输送系统，该水凝胶由带有阳离子胆固醇基的支链淀粉（cationic cholesteryl group-bearing pullulan，cCHP）组成，cCHP 纳米凝胶可以将疫苗抗原捕获在其纳米级聚合物网络中，并且它们的阳离子电荷有助于将疫苗抗原有效递送至鼻腔表面。将 A 型肉毒梭菌神经毒素无毒亚基片段（clostridium botulinum type-A neurotoxin，BoHc/A）制成 cCHP 纳米凝胶（cCHP-BoHc/A）鼻内给药后可连续粘附于鼻上皮超过 10 小时，且 BoHc/A从 cCHP 纳米凝胶释放后可被黏膜 DC 有效吸收。这种疫苗输送系统无需同时使用黏膜佐剂即可诱导出血清 IgG 和 SIgA，对 A 型肉毒杆菌神经毒素产生强烈的中和反应。重要的是，经鼻给予的 cCHP-BoHc/A 不会迁移到嗅球或大脑中或在其中蓄积。此外，用含有破伤风类毒素的cCHP 纳米凝胶进行鼻内免疫可诱导强烈的抗原特异性全身和黏膜免疫反应[32]。这些研究表明，cCHP 纳米凝胶可用作无佐剂鼻疫苗的潜在蛋白的抗原递送载体，纳米凝胶抗原递送系统为开发无佐剂的黏膜疫苗创造了新的机会。

3.4 脂质体疫苗佐剂

脂质体是由一个或多个包围水室的脂质双分子层组成的球形囊泡结构。根据抗原性质的不同，亲水性抗原可以被包裹在水核内，而脂溶性抗原则被嵌入脂质双分子层。脂质体作为抗原载体的主要优点是能够保护免疫原免受恶劣的体内环境的影响，控制释放。此外，根据脂质的性质和脂质体的组成，它既可以作为疫苗载体，也可以作为疫苗佐剂，阳离子脂质体通常用作疫苗佐剂，可以提高疫苗制剂的免疫原性。

有研究表明，由二甲基二十八烷基铵（dimethyl dioctadecyl ammonium，DDA）和免疫刺激剂海藻糖 6, 6-二苯甲酸酯（trehalose 6, 6-dibehenate，TDB）组成的阳离子脂质体佐剂表现出特殊的免疫刺激活性，因为它可以导致抗原沉积，并在注射部位诱导局部炎症，最终产生强烈的体液和细胞介导的免疫反应。DDA/TDB 脂质体在鼻腔免疫后会促进粘膜 IgA 抗体的产生，体外研究表明 DDA/TDB 脂质体有效地促进了 DC 对其的摄取，并促进了 DC 的体外成熟。在鼻腔接种疫苗后，DDA/TDB 脂质体在粘膜和全身循环中产生比其他制剂更强的抗原特异性抗体反应[33]。

4 结论

黏膜表面与各个局部组织相关的独特共生微生物不断相互作用，这一特征无疑会影响相应MALT 的产生和维持，以及针对局部递送的黏膜抗原的抗原特异性免疫反应的诱导和调节。因为通过黏膜表面可感染许多不受控制的传染病，所以对黏膜免疫系统的深入了解对于促进新黏膜疫苗的开发是必要的。这些科学发现为阐明免疫学上独特的黏膜免疫系统做出了贡献，但由于该系统的各种独特和未开发的特性，以及宿主免疫系统与黏膜表面周围环境之间复杂的生物学相互作用，我们仍然没能够完全了解该系统。因此，要继续了解黏膜免疫系统的分子和细胞功能，并尝试将新技术和概念应用于疫苗表达和递送系统，以加速开发更为安全和有效的黏膜递送疫苗。