动脉粥样硬化的生物治疗研究进展

洪诗卉，伍 锋，樊 民

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，尽管多年以来在动脉粥样硬化的预防和治疗领域已经有许多深入的研究，但其仍是世界范围内死亡的主要原因[1]。当前治疗动脉粥样硬化的主流策略是采用他汀类药物治疗，但其常引起肝损伤、肌痛等不良反应，且强化降脂治疗后仍存在较高的残余风险[2-3]。因此，单纯他汀类药物已无法满足所有需求，需要寻找更有针对性的治疗策略。随着精准医疗的发展，动脉粥样硬化的生物治疗得到深入的发展，效果显著，安全性好[4]。生物治疗包括细胞治疗和非细胞治疗，其中非细胞治疗又分为抗体、疫苗、基因修饰等内容。

1 细胞治疗

1.1 基于组织修复和血管新生的干细胞治疗 近年来，干细胞技术作为第3种医疗手段，为许多“顽疾”带去了治疗的希望，而其与动脉粥样硬化对抗的表现也毫不逊色，展现了干细胞用于动脉粥样硬化的巨大潜力[5]。干细胞治疗的主要作用机制是改善自我修复、促进血管新生。近年的研究多采用间充质干细胞(MSCs)、内皮祖细胞(EPCs)、脂肪源性干细胞(ADSCs)等作为种子细胞，回输到动脉粥样硬化诱发的缺血部位，通过旁分泌作用刺激组织自我修复和血管新生。

1.1.1 MSCs MSCs是多能细胞的一种亚群，几乎可以从所有的人体器官和组织中分离出来，具有再生、多向分化和免疫调节特性，被认为是目前最有潜力的动脉粥样硬化替代治疗方法之一。MSCs在炎症等环境的刺激下通过分泌多种可溶性小分子物质、囊泡结构物质等旁分泌作用靶向EPCs、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞、T细胞等参与炎症反应、免疫作用调节，进而发挥动脉粥样硬化保护作用。近年来，有研究表明MSCs亦可通过减少内质网应激和内皮-间充质转化(EndMT)来改善棕榈酸(PA)诱导的内皮脂肪毒性，抑制内皮功能障碍[6]，抑制巨噬细胞焦死稳定斑块等机制起作用。相比单纯骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)或BM-MSCs+顺式-9、trans-11，ADSCs更适合移植治疗动脉粥样硬化[7]。

1.1.2 EPCs EPCs是一类具有高增殖潜能的前体细胞。在动脉粥样硬化的发展过程中，存在修复损伤内皮的EPCs耗竭，即EPCs依赖性的动脉修复缺乏。pCMV6介导的二甲基精氨酸二甲基氨基氢化酶(DDAH2)基因过表达可以促进EPCs归巢，提高分化内皮的完整性[8]。过表达骨钙素的EPCs分泌的外泌体促进内皮细胞增殖、EPCs迁移和血管形成[9]。有研究表明，EPCs不但可以分化为内皮细胞，还可以转分化为平滑肌祖细胞，再分化为平滑肌细胞，参与斑块的形成[9]。尽管如此，研究者仍有理由推测，动员内源性EPCs或补充外源性EPCs可能是防治动脉粥样硬化的有效措施。

1.1.3 ADSCs 脂肪组织来源的间质细胞被认为是一种潜在的对心血管修复有用的干细胞来源。大量研究显示，ADSCs主要位于机体血管外周，且具有分化为内皮细胞、平滑肌细胞等血管细胞的潜能，在血管发生和血管生成过程中起重要作用。鉴于此，很多学者把其看作是特定的血管干细胞(vascular stem cells，VSCs)[10]。EPCs在血管受损后，“远水难救近火”，然而位于血管外周的脂肪组织中有大量的ADSCs，且ADSCs具有取材方便、创伤小、来源充足以及良好的免疫获免性等优势，具有更显著、更全面、更有效的血管新生潜能，其可以通过分化为内皮系细胞、旁分泌干细胞生长因子、基质衍生因子-1、血管内皮生长因子等细胞因子促进血管形成[11]。

然而干细胞治疗动脉粥样硬化仍存在较多难题尚未解决，如干细胞移植后存活率低，趋向性较差，只有不到1%的移植细胞真正到达了靶组织，大部分移植细胞被困在肝、脾和肺，即使是归巢并移植到梗死区的干细胞也没有表现出任何证据表明其转化为新的心肌细胞。因此，仍需要大量的研究进一步解决。

1.2 基于调节炎症的细胞治疗

1.2.1 巨噬细胞 近年来，研究表明巨噬细胞在动脉粥样硬化的进展中起关键作用，斑块内微环境因素的刺激下，表现出不同的极化状态，即具有促炎作用的M1型；具有抗炎作用的M2型(M2型巨噬细胞能缩小斑块，增强斑块稳定性)；能促进氧化应激的MHEM型；具有双重作用的M4型；作用于动脉粥样硬化进展而产生的磷脂Mox型。促进巨噬细胞向M2极化可在动脉粥样硬化进展中呈现保护作用，这可能与RhoA通路有关，如西红花苷、姜黄素、人参皂苷Rg3等中药成分，以及一些已被临床证实用于治疗其他疾病的药物也被发现通过该通路起抗动脉粥样硬化的作用，如西格列汀、利拉鲁肽、二甲双胍等[12]，抗炎基因蛋白酪氨酸磷酸酶非受体2型(PTPN2)[13]、心肌蛋白相关转录因子A(MRTF-A)[14]等可以调控该通路。

1.2.2 B细胞 B细胞具有抗动脉粥样硬化和促动脉粥样硬化的双重功能，这与其B细胞亚群的属性有关。B1细胞和边缘区B细胞被认为对动脉粥样硬化有保护作用，而毛囊B细胞和天然反应激活剂B细胞被证明促进动脉粥样硬化。B细胞通过抗体产生、细胞因子释放和抗原呈递以及B细胞独特的适应高脂血症和炎症环境的方式参与动脉粥样硬化的进展。近年来，靶向B细胞作用于动脉粥样硬化效果显著。

1.2.3 T细胞 研究表明Th1细胞、CD4+CD28-T细胞和自然杀伤性T细胞(NKT细胞)具有促动脉粥样作用，而Th2细胞和调节T细胞(Treg细胞)具有动脉粥样保护作用[15]；CD8+T细胞浸润已被鉴定为小鼠和人类动脉粥样硬化的特征，在动脉粥样硬化早期，CD8+T细胞促进巨噬细胞聚集，发挥细胞毒作用，促进巨噬细胞死亡，形成坏死核心。抗体介导的CD8+T细胞耗损可以改善动脉粥样硬化[16]。T细胞的关键调节剂半乳凝素-9(Gal-9)通过清除促炎T细胞，增加Treg细胞的数量，促进巨噬细胞向M2极化等机制发挥抗动脉粥样硬化作用[17]。B细胞和CD4+T细胞利用细胞表面主要组织相容性Ⅱ型抗原(MHCⅡ)和CD40相互作用促进高脂小鼠动脉粥样硬化，因此，靶向B细胞和CD4+T细胞相互作用可能是限制动脉粥样硬化进展的治疗策略[18]。

1.2.4 树突状细胞(dendritic cell，DC) 树突状细胞的成熟有助于动脉粥样硬化的发展。白细胞介素-37(IL-37)通过白细胞介素-1受体8(IL-1R8)-Toll样受体4(TLR4)-核转录因子-κB(NF-κB)通路抑制树突状细胞成熟，减轻ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化[19]。树突状细胞自噬破坏诱导一种反调节反应，维持高脂饮食下低密度脂蛋白(LDL)受体基因敲除(LDLR-/-)小鼠的免疫稳态，并限制动脉粥样硬化发生。在树突状细胞中选择性调节自噬可能是一个有效的治疗靶点[20]。

1.2.5 血小板 血小板除了止血功能外，还参与了动脉粥样硬化的早期过程，通过分泌大量趋化因子，包括CXC趋化因子配体(CXCL)4或血小板因子4(PF4)、趋化因子配体L5(CCL5)、CXCL12或基质细胞衍生因子-1 α(SDF-1 α)、CXCL16等启动或促进血管损伤部位的局部炎症过程[21]；诱导巨噬细胞中的细胞信号转导抑制因子3(SOCS3)通过促进巨噬细胞偏向M1炎性表型[22]等途径参与动脉粥样硬化进展。因此，血小板应该仍然是一级预防方法的主要靶点。当前研究表明可以靶向Bcl-xL促进血小板凋亡，选择性减少循环血小板，从而降低糖尿病病人动脉粥样硬化和心血管疾病风险[23]。

2 非细胞治疗

2.1 抗体

2.1.1 前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)相关单克隆抗体

2.1.1.1 依洛尤单抗 2018年7月31日，中国国家药品监督管理局(NMPA)批准依洛尤单抗(Evolocumab，瑞百安®/Repatha®)可在国内获批用于治疗成人或12岁以上青少年纯合子型家族性高胆固醇血症(HoFH)；2019年1月24日，安进公司(Amgen)宣布NMPA批准其新的适应证，用于成人动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)的治疗，以降低心肌梗死、脑卒中和冠状动脉血运重建的风险。Evolocumab成为首个获得ASCVD适应证的PCSK9抑制剂。Evolocumab已被证明可有效降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，并进一步降低心肌梗死和脑卒中风险。FOURIER研究纳入25 096例病人，中位随访2.2年，与他汀类+安慰剂组相比，他汀类+Evolocumab组脂蛋白(a)[Lp(a)]降低26.9%，心肌梗死风险降低27.0%，脑卒中风险降低21.0%，冠状动脉血运重建风险降低22.0%；FOURIER研究亚组分析结果显示，Evolocumab在亚洲人群中降低心血管事件的有效性和安全性与非亚洲人群一致[24]。但也有研究表明，尽管服用Evolocumab后可明显降低LDL-C，但存在动脉壁持续炎症[25]。

2.1.1.2 Alirocumab Alirocumab是人类单克隆抗体的IgG1型，也是PCSK9抑制剂。在皮下给予Alirocumab后，游离PCSK9的最大抑制发生在4～8 h内，并且具有17～20 d的表观半衰期。抑制是剂量依赖性的，抗体通过循环分布，并通过与其靶标结合以低浓度消除，并通过蛋白水解途径以较高浓度消除[26]。在对18 924例心血管疾病病人平均随访2.8年后发现，使用Alirocumab治疗后明显降低主要心血管不良事件和死亡率[27]。在既往有急性冠脉综合征并接受高强度他汀类药物治疗的病人中，接受Alirocumab的病人复发缺血性心血管事件的风险比接受安慰剂的病人低[15]。

2.1.2 血管生成素样蛋白3(Angptl3)单抗 Evinacumab是Angptl3的抑制剂。治疗24周后LDL-C下降47.1%，胆固醇下降43.4%，载脂蛋白B、非高密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和总胆固醇水平也显著降低，并且该抗体治疗总体耐受性良好，最常见的不良反应是流感样疾病，但也仅有11%接受Evinacumab治疗的病人出现该反应[28]。目前，食品药品监督管理局(FDA)批准其作为结合子型家族性高胆固醇血症(HoFH)病人的辅助用药。

2.1.3 白细胞介素-1(IL-1)相关单克隆抗体 IL-1能够特异性地促进血管粥样硬化斑块的形成、生长和破裂，这是缺血性心血管并发症的原因[29-30]。白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-1α(IL-1α)在动脉粥样硬化病变中均高表达，并通过诱导内皮细胞表达黏附分子促进白细胞募集[31]；临床实验证据表明，这些效应可以被IL-1β抑制剂逆转，因此，选择性药物封锁是抑制动脉粥样硬化病变进展的合适治疗策略[30]。

2.1.3.1 Canakinumab Canakinumab是一种靶向IL-1β的单克隆抗体，CANTOS研究表明，每3个月150 mg的Canakinumab可明显降低心血管事件的复发率及血脂水平[31]，该结果是通过白细胞介素-6(IL-6)信号通路介导的[32]。一项对CANTOS研究的二次分析表明，采用Canakinumab治疗的病人中，相较于超敏C反应蛋白(hs-CRP)浓度≥2 mg/L的病人，hs-CRP<2 mg/L的病人主要心血管不良事件减少了25%，心血管死亡率和全因死亡率都降低了31%[33]。

2.1.3.2 Anakinra Anakinra是IL-1受体拮抗剂(IL-1Rα)，可以阻止IL-1α和IL-1β与白介素1受体Ⅰ(IL-1R1)的结合[34]。Anakinra可以降低胆固醇，这可能与骨髓和脾脏中的单核细胞增多有关；增加动脉粥样硬化斑块稳定性，这与脾髓外骨髓生成减少引起的循环单核细胞减少有关[35]。CANTOS研究显示了一种潜在的危险，Canakinumab的使用增加了机会性感染的风险，但概率很小。

2.1.3.3 Rilonacept Rilonacept是一种皮下注射的可溶性融合蛋白，由IL-1R1胞外部分的配体结合域，和IL-1受体辅助蛋白(IL-1RAcP)呈线性连接至人免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc结合域。通过充当一种可与IL-1α和IL-1β结合的受体来抑制IL-1的信号传导，从而阻断其与细胞表面IL-1受体相互作用。Rilonacept的Ⅱ期临床试验中取得积极结果，试验结果显示，在6个月的治疗期间，与病人的自然病史相比，接受Rilonacept治疗病人的心包炎发生率从每年3.9次降至低于每年0.18次[36]。此外，Rilonacept可明显降低C反应蛋白(CRP)水平，从而改善动脉粥样硬化病人动脉功能。也有试验表明，抗IL-1药物可能由于反弹现象而使不良事件发生风险增加，但这是基于对少数事件的事后分析，并没有得到所有其他相关试验的支持。此外，成本问题也限制了这些治疗策略在临床的实际应用。

2.1.4 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体单抗 NLRP3是由细胞内模式识别受体(PRR)诱导的多种蛋白组成的复合体，能促进细胞因子IL-1β、白细胞介素-18(IL-18)的前体分泌和成熟[37]。

2.1.5 IgM E06单抗 IgM E06是以氧化磷脂(OxPL)的磷酸胆碱头基团为抗原的天然抗体，研究表明IgM E06可以使动脉粥样硬化病变发生率减少。主动脉瓣超声心动图和组织学检查显示，IgM E06可以减少了主动脉瓣钙化，降低腹膜巨噬细胞中胆固醇的积累和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的体内摄取，腹膜和主动脉巨噬细胞的炎症表型均减少。血清淀粉样蛋白A降低32%，提示全身炎症减轻。IgM E06有助于减少全身炎症，延缓动脉粥样硬化、主动脉狭窄的进展[38]。

2.1.6 CD抗体 CD3-Ab治疗通过减少CD4+T细胞和增加Treg细胞的比例诱导动脉粥样硬化的快速消退[39]。研究表明，动脉粥样硬化的形成与CD47的上调有关，CD47封闭抗体可以使病变血管组织的清除正常化，并改善多只小鼠的动脉粥样硬化[40]。

2.2 疫苗 动脉粥样硬化过程存在自身免疫成分，可通过免疫方法(包括接种疫苗)进行调控。因疫苗具有抗原特异性，可以靶向提供长期治疗，并对机体产生较少的副反应。

2.2.1 针对PCSK9的疫苗

2.2.1.1 PCSK9Qβ -003 PCSK9Qβ -003是一种靶向PCSK9的治疗性疫苗，该疫苗能明显降低ApoE-/-小鼠的总胆固醇和LDL-C，减小斑块大小，增加斑块稳定性，降低巨噬细胞的浸润、单核细胞趋化蛋白-1、肿瘤坏死因子-α的表达，减少ApoE-/-小鼠主动脉病变区细胞凋亡，其机制为PCSK9Qβ -003上调肝脏X受体和ATP结合盒转运体A1的表达水平[41]。

2.2.1.2 抑制PCSK9的多肽疫苗 该疫苗由短肽结合锁眼帽贝血青素(KLH)作为载体蛋白组成。在ApoE-/-小鼠中加入佐剂接种疫苗，可显著诱导抗PCSK9抗体反应，血浆总胆固醇、极低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒(CM)水平持续下降达24周，免疫小鼠细胞表面LDL受体表达显著增加。用KLH而非PCSK9作用于ApoE-/-小鼠，可以诱导γ干扰素(INF-γ)和白细胞介素-4(IL-4)的产生[42]。

2.2.1.3 与米脂质体结合的PCSK9-tetanus融合的免疫原性肽(L-IFPTA+) 该疫苗为免疫原性融合PCSK9-tetanus的免疫原性肽使用DSPE-PEG-马来酰亚胺脂质(L-IFPT)在纳米脂质体表面结合，并吸附到水凝胶(R)上而形成的一种疫苗，在严重动脉粥样硬化小鼠体内产生长效、功能性、安全的PCSK9特异性抗体，并对高胆固醇血症和动脉粥样硬化具有长期治疗作用[43]。

2.2.2 血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)疫苗 ATRQβ001疫苗是针对AT1R中的肽ATR001。ATRQβ001疫苗可以诱导抗ATR001单克隆抗体(McAb-ATR)的产生，并在没有反馈性激活肾素-血管紧张素系统(RAS)的情况下，通过调节β -arrestin2抑制动脉粥样硬化[44]。

2.3 基因修饰 特异性沉默PCSK9 mRNA Inclisiran是特异性沉默PCSK9 mRNA的小干扰RNA(siRNA)，使PCSK9蛋白表达减少，从而减少LDL-C受体降解，增强肝细胞对LDL-C的清除能力，使LDL-C水平降低。ORION-1研究结果表明， Inclisiran使LDL-C降低52.6%，接近使用PCSK-9抗体的疗效。ORION-10和ORION-11研究结果表明，Inclisiran分别使LDL-C降低52.3%和49.9%，且不良事件发生率低(分别为2.6%和4.7%)[45-46]。ORION-4结果尚待公布[47]，计划随访5年。EMA的人用药品委员会(CHMP)建议Inlisiran用于治疗患有高胆固醇血症或混合性血脂异常的成年人，可能批准该药上市。特异性修饰载脂蛋白C3(ApoC3) mRNA Volanesorsen是一种与ApoC3 mRNA结合的反义寡核苷酸，可使ApoC3降解，抑制三酰甘油(TG)代谢和乳糜粒在肝脏的清除。Volanesorsen的Ⅰ期临床试验表明，其可使TG降低75%， LDL-C降低25%，HDL-C升高75%；Ⅱ期临床试验表明，TG降低62%，极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)降低60%，HDL-C升高42%[48]。Ⅲ期临床试验表明，3个月后ApoC3平均下降84%，6个月后ApoC3下降83%，TG下降77%[49]。COMPASS试验表明，Volanesorsen可使空腹TG≥500 mg/dL(5.65 mmol/L)的病人胰腺炎的发病率显著降低[50]。目前，Volanesorsen已获得美国FDA的“条件授权”，用于胰腺炎的高危病人以及其他药物和低脂饮食均治疗不佳的病人。

特异性修饰Lp(a) mRNA Pelacarsen(TQJ230)是特异性进入肝脏抑制Lp(a)mRNA的反义寡核苷酸(ASO)，可以降低Lp(a)水平。Ⅱ期临床试验表明，每周20 mg的Pelacarsen能使Lp(a)降低35%～80%。2020年开始的Ⅲ期临床试验目前正在进行中，预计在2024年明确伴随Lp(a)大幅度下降是否会带来心血管事件的减少[51]。

3 其他生物治疗方案

也有研究者采用外泌体(Exosomes)制备富含miRNA的药物投递系统等方式治疗动脉粥样硬化相关性疾病。有研究显示，M2巨噬细胞来源的外泌体(M2 Exo)具有抗炎性和抗炎能力，该特性通过其表面结合趋化因子受体和抗炎M2巨噬细胞释放的细胞因子实现[52]。在人脐静脉内皮细胞损伤模型中纺锤形脂肪细胞产生的外泌体抑制miR-342-5p表达从而保护内皮细胞损伤，防止动脉粥样硬化[53]。自MSCs的外泌体可通过miR-let7/高迁移率族蛋白A2(HMGA2)/NF-κB通路改善ApoE-/-小鼠中的动脉粥样硬化，能够迁移到动脉粥样硬化斑块，并选择性地在巨噬细胞附近定居，降低了ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块面积，并大大减少了斑块中巨噬细胞的浸润，诱导巨噬细胞向M2极化[54]。MSCs衍生的富含miR-145的外泌体可以有效地将miR-145从MSCs传递到人脐静脉内皮细胞，下调其靶向基因JAM-A，抑制体内迁移，减少体内动脉粥样硬化斑块[55]。从MSCs来源的细胞外囊泡转移microRNA-221可抑制动脉粥样硬化斑块的形成[56]。

4 小 结

以动脉粥样硬化为病理基础的动脉粥样硬化性心血管疾病是严重危害人类健康的最主要疾病，在我国的发病率逐年上升并有年轻化趋势，其死亡人数已占总死亡人数的35%～40%。每年用于治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的费用在千亿元以上。虽然目前综合药物和介入、搭桥等治疗有效降低了此类病人的急性期死亡率，但对病人的长期预后改善仍较有限。随着精准医学的发展，生物治疗为动脉粥样硬化相关性疾病治疗带来更优化的效果、更安全性的策略。也有学者认为21世纪将是生物治疗的时代。然而，细胞治疗与非细胞治疗仍然存在很多局限性，限制其临床转化。需要更加深入的基础研究以及大样本、多中心的临床研究来进一步明确其有效性和安全性。