非结核分枝杆菌的临床检测研究进展

潘 晴 暴芳芳 刘 红 张福仁

山东第一医科大学附属皮肤病医院(山东省皮肤病医院，山东省皮肤病性病防治研究所)，济南，250022

分枝杆菌是细菌中重要的一类，属放线菌目、分枝杆菌科，主要包括结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)和非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobarteria, NTM)[1,2]，其可通过多种途径如皮肤、呼吸道、消化道等进入人体，激活细胞免疫；亦可引起局部的免疫反应(免疫细胞的聚集及相关细胞因子、趋化因子等的释放)，形成肉芽肿。其中，非结核分枝杆菌(也称非典型分枝杆菌)在我们周围的环境中无处不在，包括水、土壤、动物、植物、乳制品和其他食品，目前已鉴定出180多种NTM[3]，主要包括海分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌等。非典型分枝杆菌易引起肺部及皮肤感染，引发肺部疾病最为常见。自20世纪90年代中期以来，特别是随着艾滋病的流行、器官移植以及免疫抑制剂应用的增多，非结核分枝杆菌感染患病率不断上升[4,5]。结核分枝杆菌感染与NTM感染临床表现相似，临床医生易将非结核分枝杆菌疾病误诊为结核分枝杆菌病或者真菌感染如“孢子丝菌病模式”[6,7]，采取了不当的治疗手段，对患者病情造成不良影响[8]，因此，对感染菌株进行鉴定对于非结核分枝杆菌感染性疾病的诊疗至关重要。本文对于非结核分枝杆菌在国内外检测鉴定的研究现状做出如下综述。

非结核分枝杆菌一般分为2类，快生长分枝杆菌(rapid growing non-tuberculous mycobacteria，RGM)和慢生长分枝杆菌(slowly growing non-tuberculous mycobacteria，SGM),在营养丰富、温度适宜的条件下培养，7天内肉眼可见单个菌落者为快生长菌(RGM)，大于7天者则为慢生长菌(SGM)[9]。目前鉴定方法主要有传统检测法、PCR-核酸序列检测法、qPCR法、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析法、PCR单链构象多态性(PCR-SSCP)法、基因芯片法、速生型非结核分枝杆菌快速MIC鉴定法、免疫学鉴定法等。

1 传统检测法

虽然，NTM感染与MTC感染临床表现极为相似，但是NTM感染仍反应出特殊性，若患者合并肺部基础疾病并伴咯血，肺高分辨CT空洞发生率高，病灶内干酪化较少，钙化较低，PPD试验(结核菌素试验)阴性，以及运用治疗结核病方法效果不明显等症状时，则应考虑是否为NTM感染[10]。应立即将患者痰涂片进行抗酸染色，但此方法不能区分麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌复合群以及非结核分枝杆菌，若抗酸染色为阳性结果，应再进一步利用培养基进行培养，并分离菌株进行 PNB(对硝基苯甲酸)生长实验，以此判断此菌株是快速型(RGM)或缓慢型分枝杆菌(SGM)以及是否为非结核分枝杆菌，并且抗酸染色法存在阳性率不高的缺点[11-13]。Wang等[14]在培养基中加入500 μg/mL的PNB可选择性抑制MTC，但是NTM菌株具有抗性，通过液相色谱-串联质谱法(LC/MS/MS)对PNB的还原产物进行鉴定，发现只有NTM菌株可检测到该产物，以此对MTC、NTM进行鉴别。但是，此法耗时长。

2 PCR-核酸序列检测法

16S rRNA基因是细菌鉴定最常用的基因，然而，该基因在不同的分枝杆菌物种中具有高度相似的序列，因此无法区分密切相近的非结核分枝杆菌物种。为了克服这些局限性，最近的研究利用其他基因，如hsp65和rpoB来准确鉴定NTM,序列数据分析需利用 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)公共数据库[15]。

(1)普通PCR法：M. Saifi等[16]利用hsp65基因测序鉴定了48株分枝杆菌，其中包括32株NTM。Cheng等[17]从奶牛身上采集320份可见病变组织，其中11个样本显示典型肉芽肿病变，共培养得到8例菌株，对其进行3个基因(16S rRNA、hsp65和rpoB)测序以鉴别物种。Joao等[18]对22株参考菌株和54株临床分离株利用16S rRNA、hsp65基因测序进行鉴定，鉴定率与商用试剂盒相比显著提升。Varahram等[9]对水和土壤标本进行16s-23s rRNA和hsp65基因进行测序，344例RGM中鉴定出322例(94.4%)。

(2)巢式PCR：巢式PCR是一种先利用外部引物扩增基因组中的特异性区域，将细菌鉴定至属、种水平，再利用内部引物扩增基因组中的特异性区域，将细菌鉴定至种甚至亚种水平的方法[19]。李学渊等[20]利用巢式PCR检测手部慢性肉芽肿标本37例，有22例非结核分枝杆菌阳性。林爱红等[21]利用巢式PCR检测公共场所中水、土壤、风管积尘和气溶胶样本中结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，并对阳性率进行分析。

(3)多重PCR：多重PCR是指在同一PCR反应体系中，同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增，可用于同时检测多种病原体。该方法具有高效、低成本、速度快等优点，有较好的可操作性[22]。Kim等[15]分别利用这3个基因(16S rRNA、hsp65和rpoB)对109例临床菌株测序，物种鉴别率分别为 71.30%、86.79%和81.55%，但使用多重PCR的方法可使物种鉴别率提高到97.25%。Chae等[23]对55株参考菌株和94株分枝杆菌临床分离株进行多重PCR检测，检测结果与标准一致。

3 荧光定量PCR(qPCR)技术

qPCR检测技术原理是在普通PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[24]。qPCR产物分析不用打开PCR反应管，可减少核酸实验室污染风险，对于定性检测是非常重要的优点，此外该方法还具有准确度高、灵敏、特异性强和检测快速的优点。Lee等[25]采用实时荧光定量PCR试剂盒(Genetree Research Inc., Seoul, Korea)检测痰标本、支气管冲洗和培养标本中MTBC、NTM，敏感性可达98%以上，特异性100%。王旭洲等[26]采用荧光定量PCR技术对200例肉芽肿病变进行分枝杆菌检测，其中100例结核分枝杆菌阳性，3例非结核分枝杆菌阳性。Rahman等[27]利用LyteStar TB/NTM qPCR试剂盒(Altona Diagnostics，德国)，分析了782例疑似结核患者的临床标本，检测出49例MTB、74例NTM阳性样本。

4 PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析法

PCR-RFLP分析法是通过PCR扩增分枝杆菌相对保守的基因片段，根据分枝杆菌保守基因组DNA片段内的限制性酶切位点的不同，将扩增产物经限制性内切酶消化切割成不同大小片段，进行琼脂糖凝胶电泳分析。此项技术提高了目的DNA含量和相对特异性，而且方法简便，分型时间短[28]。Davar等[29]采用PCR-RFLP技术对8166例临床样本进行鉴定，结果有61例为NTM。Farnia等[30]采用PCR-RFLP技术，利用hsp65基因对分枝杆菌进行分子鉴定，确诊了80位NTM感染患者。LI等[31]通过PCR-RFLP技术，利用hsp65、rpoB基因对分型为疑似龟/脓肿分枝杆菌复合群的27例临床样本进行鉴定，结果有18例为脓肿分枝杆菌，4例为溃疡分枝杆菌，剩余5例为其他分枝杆菌。

5 PCR单链构象多态性(PCR-SSCP)分析法

PCR-SSCP是利用DNA单链构象具有多态性进行基因检测的一种分析技术，该技术敏感性高、操作简便，广泛应用于多种基因突变的检测和基因多态性分析，近年来，PCR-SSCP技术被大量应用于细菌、分枝杆菌等的分类分型研究中[32]。不同种的DNA单链其空间构象不同，在非变性PAGE电泳中的迁移率也不同，最终呈现不同的带谱，从而达到菌种鉴定的目的[28]。靳晓红等[33]通过设计两对引物分别扩增16S rDNA两条片段，根据SSCP电泳图谱对98株临床分离株进行鉴定，结果有93株为结核分枝杆菌复合群，5株非结核分枝杆菌。

6 基因芯片法

基因芯片(genechip)(又称DNA芯片、生物芯片)的原理是杂交测序，随着90年代以来基因芯片技术的不断发展，该技术开始应用到分枝杆菌的检测中。与传统方法相比，基因芯片技术具有快速、结果可靠、重复性好、通量高的特点，为分枝杆菌的实验室诊断开拓新途径。李晓非等[34]对656例抗酸染色阳性的肺结核患者痰标本采用基因芯片法进行菌种鉴定，检出21例NTM，与培养法一致。Zhu等[35]基于16S rRNA建立生物芯片检测系统，对64株参考菌株、296株MTC、243株NTM、138株其他菌落、195份痰标本进行鉴定，结果与DNA测序一致率达100%。常凤霞[36]选取324例临床上怀疑分枝杆菌感染患者，采集其尿液、痰液及脓液标本，分别采用基因芯片法、涂片抗酸染色技术进行检测，结果基因芯片技术阳性率9.57%，高于涂片抗酸染色技术(7.41%)。

7 速生型非结核分枝杆菌快速MIC鉴定法

RGM-NTM快速MIC鉴定法是一种采集疑似患者呼吸道分泌物(痰液、支气管冲洗液、肺泡灌洗液等)在适当的非结核分枝杆菌培养基中培养，利用其采集标本的耐药性检测来诊断非结核分枝杆菌及其种类的方法[37]。陈品儒等[38]采用快速生长分枝杆菌药敏试验液基微量稀释 MIC 法，以添加阳离子的 MH2(Mueller- Hiuton)肉汤为培养基，按照结核病诊断细菌学检验规程对202株致病性NTM进行8种药物敏感性测定。8种药物包括阿米卡星(AMK)，头孢西丁(CXT)，环丙沙星(CIP)，克拉霉素(CLA)，多西环素(DCC)，利奈唑胺(LZD)，复方磺胺甲基异恶唑(SMZCO)，妥布霉素(TOB)。结果分离鉴定出龟分枝杆菌128株，脓肿分枝杆菌56株，偶发分枝杆菌9株，龟-脓肿及龟-偶发复合群9株。 我国NTM检出以速生型非结核分枝杆菌为主，常见菌种主要为龟-脓肿分枝杆菌复合群、偶发分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌等[39，40]。因此，该方法有较高的临床诊断价值。

8 免疫学鉴定法

分枝杆菌生长过程中会分泌200多种蛋白，最具特异性的蛋白MPB64(mycobacterial protein from BCG of Rm0. 64 in electrophoresis)，是由结核分枝杆菌分泌到菌体外的，而非结核分枝杆菌则不分泌该蛋白，因此，通过检测和鉴定 MPB64可以鉴别 MTB 和 NTM。Abe等[41]以20株结核分枝杆菌参考菌株和111株临床分离菌株为研究对象，采用免疫色谱法(MPB64-ICA)对结核分枝杆菌复合物进行了鉴定，结果只有结核分枝杆菌呈现阳性，然后又对362例痰标本中抗酸杆菌阳性的108例进行鉴定，51例为结核分枝杆菌，其它为NTM。张帆等[42]对89例分枝杆菌培养阳性痰标本，采用胶体金法进行结核分枝杆菌MPB64抗原检测，结果有25例检测阴性，确诊为NTM，该方法检测NTM，敏感性为96.9%，特异性为100%。潘爱珍等[43]分别采用MPB64免疫胶体金法和传统PNB/TCH法对2种分枝杆菌标准菌株和418株临床分离株进行鉴定，与PCR测序方法相比，结果二者一致率分别为95.93%、87.08%。MPB64免疫胶体金法在分枝杆菌菌种鉴定中，特异度灵敏度较高，方法简便、快速，适合推广应用。

9 其他鉴定法

其它检测方法主要有药敏学方法、三磷酸腺苷(ATP)发光法、结核T淋巴细胞斑点试验(T-SPOT. TB)等。药敏学检测非结核分枝杆菌是一种检出率高、检测结果较为准确的方法，其中鸟分枝杆菌利用药敏学检测方法检出率高[12]。李洪敏等[44]通过新型BACTEC MGIT 960全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪鉴定分枝杆菌，与培养法相比缩短了时间，结核分枝杆菌平均7.2天，非结核分枝杆菌最快仅需1天即可报告结果，该仪器自动化程度高、方法简便。三磷酸腺苷生物发光法是一种经过简化的生物化学方法，利用ATP与荧光素-荧光素酶复合物的反应来测定是否存在三磷酸腺苷(ATP)。在PNB培养管中一旦有菌生长则其ATP的含量就会随之升高，反之其ATP的含量则会降低。刘君等[45]对69例临床菌株进行鉴定，评估ATP发光法准确率达98.6%(68/69)。T-SPOT．TB是一种γ干扰素释放试验(interferon-gamma release assay)，通过检测外周血中经结核分枝杆菌特异性抗原早期分泌靶向抗原(early secreting antigen target 6．ESAT-6，6 kD)和培养滤过蛋白肽段库(culture filtrate protein 10，CFP．10，10 kD)刺激后释放γ干扰素的T淋巴细胞，并据此结果判断是否感染结核的技术[46]。该技术主要应用于结核分枝杆菌感染的诊断和后续监测，而对于非结核分枝杆菌感染的意义未被充分认可。目前已有报道显示，海分枝杆菌[46]、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌[47]、堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌[48]等多种NTM可导致T-SPOT. TB阳性。

10 小结

综上所述，NTM大多属于条件致病菌，在周围环境中分布范围广，容易感染免疫力低下的人群。近年来，NTM感染发病率增高，其危害性也越来越受到重视。NTM感染临床特征与结核病很相似，容易造成漏检或误诊，延误临床的治疗，因此，NTM的检测与鉴定尤为重要。传统的检测方法耗时长，限制了临床应用，当前，分子生物学技术大力发展，可对非结核分枝杆菌进行快速准确地分析，在NTM菌种鉴定方面展现出独特的优势和广泛的应用前景，但为使检测结果更可靠，应结合细菌学、免疫学等方法，通过多种技术同时鉴定，充分发挥各方法的优势，使鉴定结果更加准确，以便更好地辅助早期NTM感染疾病的临床诊疗。