MicroRNAs作为诊断结核性脑膜炎生物标志物的研究进展

让昕铭综述，付 锦审校

结核是目前全球最致命的单一传染病，结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)是其最严重的疾病形式，引起以脑膜为主的中枢神经系统慢性感染性疾病。进行抗结核化疗和糖皮质激素辅助治疗后仍有几乎一半的TBM患者死亡或遗留严重的神经系统后遗症，延误诊断及治疗被认为是高死亡率和致残率的主要原因。由于临床表现不典型，目前TBM的诊断主要依靠脑脊液(cerebro-spinal fluid,CSF)结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)培养。然而，MTB培养敏感性仅为45%～60%，且需要2～8 w才能得到结果[1,2]。因此，为TBM寻找特异、快速而敏感的诊断标志物具有重要价值。微小RNA (microRNAs,miRNAs)是一种长度约为22个核苷酸的保守非编码小分子RNA，通过与靶基因的3'非翻译区结合调控基因表达，在健康个体中有助于维持免疫稳态。然而，在不同的疾病中miRNAs的表达水平有明显的改变，其中miR-155已被确定为诊断乳腺癌的新型生物标志物[3]，提示miRNAs可作为疾病的确诊指标。研究显示，miRNAs在TBM发病中起着至关重要的作用，在TBM患者中已观察到miRNAs谱的异常表达，但目前关于miRNAs如何参与TBM发病机制的研究十分有限。因此，本文总结了近年来有关TBM中miRNAs谱的报道，论述miRNAs作为诊断TBM生物标志物的研究进展，为其在TBM诊治中的进一步研究提供帮助。

1 TBM诊断研究进展概述

TBM早期诊断和治疗是减少致残率和死亡率的有效手段。目前TBM诊断仍然是个临床挑战，主要依据微生物学和分子学检测诊断。长期以来，TBM的微生物诊断手段主要集中于CSF齐尔-尼尔森(Ziehl-Neelsen,Z-N)染色和MTB培养，但这两种方法在临床应用上都受到CSF细菌载量低的阻碍。CSF涂片敏感性很低，对于高细菌负荷相关的结核病可达50%，TBM等少菌性疾病的敏感性仅为10%～20%。MTB培养显示出相对较高的敏感性(45%～60%)，但其培养周期较长，在固体培养基上耗时长达8 w，在液体培养基上也至少需要10 d，限制了其在临床工作中的应用价值[1,2]。尽管已在液体培养基中开发出检测MTB的新方法-显微镜观察药敏试验(microscopic observation of drug susceptibility,MODS)，但目前几项实验表明，其培养时长也需要1 w左右，仍然无法实现早期诊断[4]。由于微生物诊断敏感性低，耗时长，常导致延迟治疗，推动了基于核酸扩增的分子学检测的发展，分子结核病快速诊断领域取得了突破性的进展。

Xpert MTB/RIF(Xpert)是一种基于实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)的分子学诊断方法，不仅可以检测MTB，还可以检测与利福平耐药性相关的突变，已被世界卫生组织(World Health Organization,WHO)推荐用于TBM的早期诊断试验。然而，目前3项探讨Xpert对TBM诊断作用的研究表明，该检测方法对TBM的灵敏度从59%～80%不等，受所测CSF容量、检测前是否离心以及诊断金标准选择等因素的影响较大，且阴性预测值较低(78.8%)，可能导致漏诊及死亡，无法成为TBM的单一检测方法[5～7]。第二代检测手段，Xpert MTB/RIF Ultra(Xpert Ultra)最近已被开发出来，其对TBM诊断的灵敏度相较Xpert提高了25%，尤其表现在CSF涂片和MTB培养敏感性较低的部位，2017年已被WHO推荐成为Xpert的替代品。然而，Xpert Ultra的阴性预测值仍然过低(76.4%)，无法作为TBM的排除标准[7]。另外，γ-干扰素释放试验、CSF中腺苷脱氨酶检测及影像学手段也可用于TBM的诊断，但均因灵敏度及特异性不足，实验数据异质性而无法广泛应用于临床，为TBM找到特异、快速且高效的诊断标志物迫在眉睫。

2 miRNAs的产生及生物学作用

顾名思义，miRNAs是一类长度约为22个核苷酸的非编码小分子RNA，其中大多数在不同物种之间高度保守。人类基因组共编码超过2000个miRNAs，其生物发生通常始于由RNA聚合酶(Pol)Ⅱ或RNA Pol Ⅲ转录形成的初级转录物(pri-miRNAs)。这些pri-miRNAs的长度有时甚至超过1000个核苷酸，具有5’帽子结构和3’多聚腺苷酸化尾，可由RNA酶III核酸内切酶Drosha进一步加工形成约70个核苷酸长的前体miRNAs(pre-miRNAs)。随后，pre-miRNAs借助输出蛋白5(Exportin-5)及其辅助因子Ran-GTP从核内穿梭进入细胞质，在胞质被Dicer酶识别并修剪成为长约22个核苷酸的成熟miRNAs。成熟miRNAs与RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)结合形成miRISC，进而与靶mRNAs的3’非翻译区结合导致其翻译受阻或降解，在转录后水平抑制靶基因表达[8]。

研究表明，单个miRNA可以靶向作用于多个mRNAs，一个mRNA也可以被几种不同的miRNAs靶向调控，构成复杂的调节网络。据估计，miRNAs可调控超过50%的细胞mRNAs，在细胞增殖、分化、凋亡、机体发育和维持生理功能等方面发挥关键作用[9]。不仅如此，miRNAs的异常表达与多种疾病的发生发展密切相关，miR-141在前列腺癌患者血清中表现出最显著的差异表达(46倍过表达)，能以60%的敏感性和100%的特异性区分前列腺癌患者和健康对照组[10]，而miR-326是一种在肿瘤和自身免疫病中具有功能相关性的关键miRNA，可作为导管腺癌、肝细胞癌及多发性硬化等多种疾病的诊断标志物[11]。由此可见，miRNAs在疾病诊断方面具有良好的临床应用前景，可能是多种疾病潜在的生物标志物。近年研究表明，miRNAs参与调节宿主细胞对病原体的免疫应答，是MTB逃避免疫攻击的重要效应因子[12]，这一发现为miRNAs作为诊断结核病等传染性疾病的生物标志物提供可能。

3 miRNAs是诊断结核病的生物标志物

3.1 血液中miRNAs是诊断结核病的生物标志物 随着近些年来转录组学的不断发展，miRNAs测序筛选及实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)验证已成为目前的主流研究手段。2013年的两项针对血清的研究表明，6种(miR-378、miR-483-5p、miR-22、miR-29c、miR-101和miR-320b)和15种(let-7e、miR-146a、miR-148a、miR-16、miR-192、miR-193a-5p、miR-25、miR-365、miR-451、miR-532-5p、miR-590-5p、miR-660、miR-885-5p、miR-223*和miR-30e)miRNAs组合具有巨大潜力，可作为鉴别肺结核患者和健康对照的生物标志物[13,14]。Latorre等对9名活动性肺结核患者、10名潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)患者及6名健康组进行全血miRNAs测序及RT-qPCR验证分析发现，miR-150、miR-21、miR-29c和miR-194是区分活动性肺结核的重要分子[15]。进一步分析发现，将活动性肺结核患者与LTBI及健康对照比较时，这4种miRNAs组合表现出显著的特异性(87.95%)及灵敏度(91.21%)。惊喜的是，上述4种miRNAs之前均被证实是免疫调控的重要分子，可为MTB的存活和增殖创造免疫学上有利的环境，故可作为结核病快速诊断的生物标志物。此外，Ndzi等利用RT-qPCR及受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析证明，另一miR-29家族成员，miR-29a-3p，在区分活动性结核患者与LTBI(84.35%)及健康对照(81.37%)时均具有良好的诊断性能，还可用于监测抗结核治疗的疗效，是结核病诊断和治疗的潜在生物标志物[16]。

3.2 细胞中miRNAs是诊断结核病的生物标志物 当前研究表明，结核是由MTB诱导的机体抵抗力降低或细胞介导的变态反应增强引起的，巨噬细胞及T淋巴细胞是机体抗结核免疫的重要效应细胞。Liu等在活动性结核患者的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)、单核细胞及单核细胞衍生的巨噬细胞中观察到miR-223表达的升高，并证实其可通过抑制促炎细胞因子产生和核转录因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)活化调节巨噬细胞功能[17]。Huang等证明miR-155在活动性结核患者的PBMC及卡介苗感染的THP-1人单核细胞系中表达显著上调，并可通过调节叉头框蛋白O3(forkhead box O3,FOXO3)的表达抑制单核细胞凋亡，有助于结核病的发生发展[18]。此外，在体外感染MTB的RAW264.7细胞(小鼠巨噬细胞)以及体内感染MTB的小鼠的肺中均观察到miR-155表达的上调[19]。一项针对CD4+T细胞的研究表明，27个miRNAs在活动性结核患者、LTBI及健康对照组间差异表达，其中miR-29水平与γ-干扰素mRNA的表达呈负相关，表明miR-29是抗结核免疫反应中的重要调节因子，可能是诊断结核病的潜在生物标志物[20]。

4 miRNAs是诊断TBM的生物标志物

4.1 血液中miRNAs是诊断TBM的生物标志物 Chai等采用RT-qPCR方法检测了20例TBM及20例原发性头痛患者血浆中miR-125b、miR-29a及miR-155-5p的表达水平，发现3种miRNAs在TBM患者中的表达水平显著升高[21]。Yuan等发现除上述3种miRNAs外，miRNA-3179a及miRNA-144在TBM患者血浆中的表达水平也显著高于对照组[22]，进一步扩大了TBM中异常miRNAs谱。一项关于血浆外泌体miRNAs的研究表明，6种外泌体miRNAs(miR-20a、miR-20b、miR-26a、miR-106a、miR-191和miR-486)在结核病患者(肺结核及TBM)中表达上调。ROC曲线分析确定，TBM组与non-TBM组相比，曲线下面积(Area Under the Curve,AUC)高达0.97，与健康对照相比，AUC可达0.86。并发现经过2个月的抗结核治疗后，上调miRNAs的表达呈下降趋势，表明此6种外泌体miRNAs可能是TBM临床诊断及治疗的生物标志物[23]。

4.2 细胞及CSF中miRNAs是诊断TBM的生物标志物 先前研究已表明，miR-29家族(miR-29a、miR-29b和miR-29c)是结核病发病过程中的关键调节因子。Pan等采用RT-qPCR分析检测miR-29a在112名TBM儿童和130名健康儿童PBMC及CSF中的表达，发现与对照组相比，TBM患儿PBMC和CSF中miR-29a的表达升高。关联分析发现，PBMC和CSF中miR-29a水平与颅内高压、意识障碍、脑膜刺激及脑外结核等表现均相关。ROC分析曲线显示miR-29a在PBMC、CSF及PBMC与CSF的组合中，均在区分TBM与健康组时表现出较好的敏感度和特异度[24]，这一结果表明PBMC和CSF中的miR-29a可能是诊断小儿TBM的生物标志物。另有两项关于TBM及原发性头痛患者的研究表明，TBM患者CSF中miR-29a的表达水平明显升高[21,22]。结核病中的另一重要效应分子，miR-155，也被验证在TBM患者的CSF中表达上调，可以成为诊断TBM的生物学标志物[22,25]。不仅如此，let-7家族的两个成员，let-7d与let-7b也被发现是诊断TBM的潜在工具，相对于健康对照组，两者在TBM患者CSF外泌体中的表达水平均显著下调，而let-7d同时可以鉴别TBM与病毒性脑膜炎(viral meningitis,VM)[26,27]。另一项针对TBM与VM的研究表明，6个miRNAs在TBM与VM，TBM与健康对照组的PBMC中差异表达。并进一步通过独立PBMC样本集(32例TBM、30例VM和34例健康对照)证实，4种miRNAs(miR-126-3p、miR-130a-3p、miR-151a-3p和miR-199a-5p)在TBM中的异常表达具有统计学意义，其中miR-126-3p、miR-130a-3p和miR-151a-3p在CSF样本中(36例TBM和34例VM)也表现出显著差异。ROC分析表明，PBMC中这4种miRNAs可将TBM与VM区分，AUC值均大于0.7，并发现这4种miRNAs的组合可以实现更好的区分能力(AUC=0.893)，可作为TBM与VM鉴别诊断的生物标志物[28]。

5 结 语

TBM是最严重的结核病形式，致死致残率高，亟需找到敏感、简便且特异的诊断标志物。目前研究已表明，miRNAs是TBM发生发展中的重要效应分子，在TBM的血液、CSF及免疫细胞中均可见miRNAs谱的异常表达，并已阐明了部分miRNAs在TBM中的作用靶点，挖掘了TBM发病过程中可能的分子机制。多项研究已证明miR-29及miR-155是TBM中有希望的诊断标志物，但其在其他疾病中同样表达异常，临床应用价值有限。我们发现miRNAs组合在TBM中的诊断潜力更大，血浆外泌体6种miRNAs(miR-20a、miR-20b、miR-26a、miR-106a、miR-191和miR-486)及PBMC中4种miRNAs(miR-126-3p、miR-130a-3p、miR-151a-3p和miR-199a-5p)组合均在TBM的诊疗方面具有良好的应用前景。然而，目前关于miRNAs对TBM作用的研究有限，未来还需进一步研究，鉴定在TBM发病过程中敏感而特异的miRNAs作为诊断标志物，为TBM的临床诊断及治疗靶点提供指导意义。