结核性脑膜炎诊断方法研究进展

王乐乐 郭建琼 杨松 唐神结

结核性脑膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是最常见的中枢神经系统结核病类型[1]，也是肺外结核最严重的形式，约占全球结核病发病数的1%[2]，占我国肺外结核发病数的7.23%[3]，但不同地区诊治现状差异较大。TBM常以非特异性症状起病，急缓、轻重不一，虽脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)指标变化明显，且多伴局灶性神经系统症状体征[4]，但不具有特异性，不能仅依靠临床症状和影像学表现确诊。并且，由于实验室检测技术对TBM检测敏感度低、耗时长，导致患者通常早期即接受经验性治疗，易致治疗延误，死亡率高达30%～40%，神经性致残率高达50%，甚至终生残疾[5-7]。笔者拟对TBM的实验室诊断、组织病理学诊断、影像学诊断等方法的研究进展进行综述，以供临床医师参考。

一、TBM诊断存在的问题

传统的TBM诊断策略是根据结核病的发病率、流行病学、体格检查、血液和CSF分析等进行疑似TBM诊断[8]。但其临床特征及传统实验室检测方法存在诸多问题。

TBM是结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)侵犯蛛网膜下间隙导致的亚急性或慢性脑膜炎症，不具有典型临床表现，易与其他形式的中枢神经系统结核病相混淆，如结核瘤和结核性脑脓肿[9]；尤其是老年TBM患者，通常需结合既往病史、实验室检测及诊断性抗结核治疗有效而确诊。葛向华等[10]分析了3例不典型TBM患者，发现其起病初期均无神经系统受累表现，仅出现不明原因发热，血常规均正常，结核菌素皮肤试验和CSF抗酸染色均阴性，抗感染治疗也无效，颈腰椎穿刺提示颅压高，CSF中葡萄糖和氯化物降低、蛋白增加，但其改变也不典型，经诊断性抗结核治疗有效而确诊。

目前，尚缺乏高敏感度和高特异度的单一诊断TBM的检测技术。传统的TBM检测方法包括抗酸杆菌涂片镜检和分枝杆菌培养。涂片镜检虽耗时短、应用广泛，但敏感度仅为10%～15%[11-12]。MTB培养虽更敏感(50%～60%)，但耗时长，难以满足临床及时性的需求[12-14]；又由于CSF中的MTB载量较低，且培养前的经验性治疗更进一步降低了MTB载量，常难以检出或呈现假阴性，加之标本获取困难，尤其是儿童患者，这些均是目前TBM诊断困难的重要原因[15-17]。

二、TBM实验室检测

目前，常用的实验室检测方法包括分枝杆菌萋-尼抗酸染色镜检、BACTEC MGIT 960(简称“MGIT 960”)培养、生化诊断、免疫学诊断、核酸扩增技术、基因测序技术。《2019中国中枢神经系统结核病诊疗指南》对于疑似中枢神经系统结核病患者，推荐行CSF的MTB快速核酸检测[如超敏利福平耐药基因检测(GeneXpert MTB/RIF Ultra，简称“Xpert Ultra”)、环介导等温扩增试验(loop mediated isothermal amplification assay，LAMP)等]、抗酸杆菌涂片镜检及MGIT 960培养；对于不能明确诊断的患者，可行多次检查以提高阳性率(强烈推荐)；当CSF送检MTB病原学标本量不足时，可优先送快速核酸检测(推荐)[4]。这提示传统的分枝杆菌萋-尼抗酸染色镜检和核酸扩增技术(如Xpert 和Xpert Ultra)均可用于TBM的快速诊断[8]。目前，在改良萋-尼抗酸染色镜检、脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)抗原检测和Xpert Ultra检测方面均有较新进展。

(一)MGIT 960培养

MGIT 960培养仍然是确诊TBM的金标准[18-19]。Krishnakumariamma等[20]发现，以MGIT 960培养结果为参照标准，Xpert检测CSF标本中MTB的敏感度和特异度分别为72.7%和98.5%，且MGIT 960检出的3株耐异烟肼(INH)的MTB中有2株经线性探针检测(line probe assay，LPA)显示对INH耐药，1株耐多药菌株经Xpert检测为利福平耐药假阴性。因此，Xpert检测阴性样本仍应进行MGIT 960培养以排除TBM。

(二)改良萋-尼抗酸染色镜检

改良萋-尼抗酸染色镜检CSF在结合患者临床症状、CSF细胞组成、生化结果和微生物检测的基础上可临床诊断TBM及提供TBM免疫监测，有助于早期诊断、最佳治疗和改善预后[21]。但目前的研究结果尚存在较大差异。如2014年我国报道传统和改良萋-尼抗酸染色镜检对TBM的检测敏感度为3.3%和82.9%[22]，但Heemskerk等[23]在一项大型前瞻性、国际多中心研究中发现，传统和改良萋-尼抗酸染色镜检检测CSF标本用于诊断TBM的敏感度分别为33.9%和34.5%，差异无统计学意义。因此，尚不能明确改良萋-尼抗酸染色镜检是否存在优势，但可在检测敏感度更佳的诊断方法出现前，充分利用现有检测手段，通过扩大CSF的检测量来优化检测结果。

(三)生化诊断

腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)在机体组织中(主要在胸腺、脾和其他淋巴组织)分布广泛，在血液中(红细胞和T淋巴细胞)含量丰富[24]。对CSF-ADA的活性检测是一种简单、快速和稳定的方法，可用于早期鉴别TBM和其他原因的脑膜炎，利于及时治疗和改善预后。

TBM患者CSF-ADA水平随有效抗结核治疗时间的延长而明显降低，且呈动态变化，有助于评价抗结核治疗的效果及判断患者病情变化。陈颜强等[25]依据英国医学研究委员会对TBM的分期标准发现，Ⅲ期患者的CSF-ADA水平明显高于Ⅰ期患者(P<0.05)，且随着治疗时间的延长CSF-ADA 水平逐渐降低，与史君华等[26]研究结果一致。另外，Chan等[19]研究显示，TBM患者的CSF-ADA活性水平[(8.6±2.1) IU/L]明显高于非TBM患者[(2.8±5.9) IU/L]，在最佳诊断截断值为5.1 IU/L时的敏感度和特异度分别为100%和91%，但目前诊断临界值仍存在争议。

(四)免疫学诊断

外周血结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)可测定MTB在特异性抗原刺激下外周血γ-干扰素(IFN-γ)释放效应T细胞的数量[27]。该试验可及时捕获细胞因子，排除免疫状态和卡介苗接种的影响，敏感度和特异度均较高[28]，已成为诊断TBM的可靠辅助参考指标之一。

张新宝等[27]研究显示，外周血T-SPOT.TB诊断TBM的敏感度为82.3%，明显高于检测CSF-ADA(61.3%)、MTB-DNA(27.4%)和抗酸杆菌涂片镜检(16.1%)，差异均有统计学意义(P值均<0.01)；且4种检测方法的受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)分别为0.815、0.661、0.637、0.581，提示外周血T-SPOT.TB诊断TBM的效能最高。王鑫和买尔旦·阿不来[29]研究发现，T-SPOT.TB与IFN-γ联合检测的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值均明显高于T-SPOT.TB和IFN-γ单项检测(P值均<0.05)；且TBM患者的CSF均呈“混合淋巴细胞反应”，与化脓性(中性粒细胞为主)和病毒性脑膜炎(淋巴样细胞反应)患者明显不同，有助于鉴别诊断。陈宇和姚素艳[30]研究发现，Xpert和T-SPOT.TB联合检测CSF标本诊断TBM的阳性率均明显高于非TBM的结核病患者，且两种方法并联诊断TBM的敏感度最高(78.57%)，准确度达71.00%；而两种方法串联及Xpert单独检测TBM的特异度均高达100.00%，无误诊。

(五)核酸扩增(nucleic acid amplification test，NAAT)技术

1.数字聚合酶链反应(digital PCR，dPCR)：是通过定量检测CSF中MTB插入序列IS6110来提高对TBM的诊断能力，是快速和敏感的分子检测方法。Li等[31]研究发现，IS6110-dPCR法的敏感度[57.4%(95%CI：44.8%～69.3%)]明显高于旋转酶B亚基(gyrase subunit B，gyrB)-dPCR法[22.1%(95%CI：12.9%～33.8%)](P<0.05)，但特异度 [分别为97.0%(95%CI：84.2%～99.9%)、100.0%(95%CI：89.4%～100.0%)]差异无统计学意义。IS6110-dPCR的敏感度也明显高于CSF涂片镜检(6.7%)、MTB培养(12.5%)、IS6110定量PCR(quantitative PCR，qPCR；21.9%)和Xpert(29.6%)，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。

2.Xpert、Xpert Ultra、LAM与LPA：Xpert和Xpert Ultra 均是WHO推荐的快速分子检测技术[32]。Xpert检测操作简单，可在2 h内获得结果，已在全球广泛应用。以MGIT 960液体培养为参照标准，Xpert检测CSF标本用于诊断TBM的敏感度和特异度分别为72.7%和98.5%，具有高特异度、中等敏感度和快速诊断特点，可作为早期诊断TBM的方法，在分子诊断中具有重要地位[33]，但由于其阴性预测值为84%，故建议对阴性样本进一步行MGIT 960培养或LPA以排除TBM[12,20]。Kay等[32]的系统综述发现，Xpert检测<15岁TBM患儿CSF的敏感度和特异度分别为54.0%(95%CI：27.8%～78.2%)和93.8%(95%CI：84.5%～97.6%)，但纳入研究的可信度较低，对于疑似TBM患儿，治疗方法和疗程应基于所有的临床信息，不应仅依靠Xpert检测结果。

Xpert Ultra弥补了Xpert在结核病诊断方面的局限性，提高了诊断的敏感度和可靠性。其体外检测下限由Xpert的100～120菌落形成单位(CFU)/ml下降至约16 CFU/ml，与MTB培养相似(约10 CFU/ml)[34]。虽然Xpert Ultra阴性结果亦不能排除TBM，但与其他实验室诊断方法比较，Xpert和Xpert Ultra仍对TBM具有较高的诊断价值，特别是Xpert Ultra可使TBM的确诊率从36%增加到51%，已被推荐为诊断TBM的首选检测技术[31]，可替代Xpert检测[35]。Bahr等[13]研究表明，Xpert Ultra诊断HIV感染与疑似TBM共病患者的敏感度为95%，确诊TBM的敏感度为95.5%(95%CI：77%～99%)，高于Xpert[45%(95%CI：24%～68%)]和MTB培养[45%(95%CI：24%～68%)]；Xpert Ultra、Xpert和MTB培养对可能和高度疑似TBM患者的诊断敏感度分别为70%(95%CI：47%～87%)、43%(95%CI：23%～66%)和43%(95%CI：23%～66%)。Huang等[36]发现，Xpert Ultra、Xpert和MTB培养诊断TBM的特异度均为100%，均可准确诊断耐药患者，且Xpert Ultra诊断TBM的敏感度(45%)明显高于Xpert(28%)和MTB培养(18%)。

以CSF中MTB培养阳性为参照标准，LAM抗原检测诊断TBM的敏感度仅为21.9%[37]。对可能和高度疑似TBM患者的CSF行新型即时护理尿脂阿拉伯甘露聚糖试验(Fujifilm SILVAMP TB LAM，FujiLAM)的检测敏感度为52%，特异度为98%[38]，与Xpert Ultra检测的敏感度(55%)接近，而Alere Determine TB LAM Ag (简称“Alere LAM”)检测的敏感度仅为14%。故在Xpert Ultra不可行的情况下可使用FujiLAM替代[38]。

Xpert Ultra和LAM检测方法使诊断TBM进入了快速诊断和早期治疗的新时代，但Xpert Ultra不能作为诊断TBM的单一诊断方法，应谨慎据此排除TBM。基于目前诊断方法的局限性，联合患者临床症状、影像学特征和其他实验室指标等多种方法对诊断TBM仍非常必要[2,39]。

(六)测序技术

1.二代测序(next generation sequencing，NGS)：CSF-NGS 可用于常规筛查MTB阴性患者，以提高病原学检出率[4]，且在CSF常规检查结果不典型的情况下，有助于早期精准诊断TBM。钱乔乔等[40]对5例TBM患儿行CSF-NGS 检查得到MTB序列，但有2例最初常规检查中为假阴性。林爱清等[41]以传统诊断方法为参照标准，发现CSF-NGS对CSF 分枝杆菌涂片、培养及MTB核酸PCR检测等传统检测阴性患者的检测敏感度为63.6%；以临床诊断为参照标准，CSF-NGS和传统检测方法检测的敏感度分别为58.8%和29.4%，特异度均为100%，但与Xpert差异无统计学意义。Yu等[42]系统分析了宏基因组CSF-NGS对TBM的诊断价值，结果显示其诊断TBM的敏感度为27%～84%，特异度为96%～100%，AUC提示诊断效果良好，可作为TBM的早期诊断方法，但各研究异质性差异明显，故应谨慎根据宏基因组NGS检测结果进行诊治，但其对亚急性和慢性脑膜炎的诊断仍具有非常好的应用前景[15]。另外，NGS存在以下局限：首先，NGS虽能准确检测病原体DNA类型，但对病原体RNA类型仍需进一步探索；其次，NGS的检测费用目前仍相对较高，限制其临床使用；再次，NGS无法确定MTB是否耐药，无法检测耐药菌株。

2.焦磷酸测序：是第一代基因型检测方法，可以在6 h内检测出MTB突变，直接诊断TBM，并可提供广泛耐药突变信息，有助于早期确定治疗决策。Ajbani等[43]研究显示，焦磷酸测序检测CSF诊断TBM的敏感度 [98.11%(95%CI：89.93%～99.95%)]明显高于Xpert和MGIT 960培养[分别为43.39%(95%CI：29.83%～57.72%)和61.04%(95%CI：55.31%～66.48%)]，差异均有统计学意义(P值均<0.01)，且焦磷酸测序的耐药检测结果与表型药物敏感性试验和Xpert耐药检测结果的符合率分别为91.30%和95.45%。

三、TBM的影像学诊断

中枢神经系统结核病最常见类型为TBM，其主要影像学特征为基底池脑膜强化、脑梗塞、脑积液和结核瘤，可单独或联合发生，颅底脑膜强化伴或不伴结核瘤是TBM最常见且特异性较高的征象。神经系统影像学检查对中枢神经系统结核病的诊断发挥了重要作用[44]。《2019中国中枢神经系统结核病诊疗指南》[4]推荐在治疗前及治疗后48 h对疑似中枢神经系统结核病患者进行头颅MRI增强或CT增强扫描，以诊断疾病、评估手术适应证和监测治疗应答；强烈推荐行胸部CT及其他部位的影像学检查以查找神经系统外的可疑活动性结核病灶，以作为临床诊断依据或进一步病原学诊断的采样部位。

四、TBM的辅助诊断

1.病理诊断：TBM患者中枢神经系统可发生多种病理性改变，包括炎性渗出、肉芽肿性病变、闭塞性血管炎、结核瘤或脓肿等[45]。其中，77%的TBM患者发生脑动脉炎，61.8%血管异常改变的TBM患者会出现脑梗塞及脑积液[46-47]。Sharifi等[48]报道了全球首例卡介苗接种后诱发脑结核瘤的患儿，该患儿在出生6个月时出现恶心、呕吐、纳差和昏迷，颅脑MRI发现松果体内一巨大团块及脑积液，外科手术取病理组织行PCR，确定为牛分枝杆菌感染，抗结核治疗效果较好。故对有卡介苗接种史的婴幼儿应警惕脑结核瘤的出现。另有报道18例误诊为垂体腺瘤的患者(仅有1例影像学检查结果为疑似结核瘤)，其中5例患者存在泛垂体功能低下征，3例催乳素水平升高；6例蝶鞍及蝶窦均受累；1例患者的病灶从鞍座延伸至斜坡；3例有肺结核病史。患者临床症状持续15 d至2年，最常见症状为头痛、视力下降或失明，组织病理学检查均显示病灶由垂体腺瘤和结核瘤组成，诊断为鞍内结核瘤。这提示当影像学显示副鼻窦和垂体窝受累及垂体增厚且同时发生斜坡(由颅骨的枕大孔向上至背鞍)时也应怀疑TBM，并建议进一步行组织病理学检查[49]。

2.临床诊断：《2019中国中枢神经系统结核病诊疗指南》推荐在缺乏病原学诊断依据的情况下，应综合临床表现、CFS表现、影像学表现和其他部位结核的临床诊断评分进行中枢神经系统结核病临床诊断，其中评分≥12分或≥10分(无法进行影像学检查时)为高度疑似，评分在6～11分或6～9分(无法进行影像学检查时)为疑似患者(推荐强度低)[4]。

TBM临床症状及体征表现多样，多以亚急性起病为主，且颅神经损伤、头痛、意识障碍、颈项强直、克氏征(Kernig征)、布氏征(Brudzinski征)、巴宾斯基征(Babinski征)等不典型表现[45]的发生率均较高，但精神症状、癫痫发作的发生率均低于病毒性脑膜炎患者[50]。因此，临床诊疗应综合临床症状、影像学特征、血清免疫学指标、血生化检测结果、CSF涂片和培养、组织病理和抗结核治疗反应等表现[30]，CSF细胞外观、ADA活性、乳酸脱氢酶、隐球菌抗原水平等也可作为重要鉴别参数[11]。

五、总结

目前，TBM的诊断仍基于传统的临床表现、影像学和实验室检查等进行评估，并对病原学不明确的TBM采用二代测序鉴定。虽然TBM的诊断研究在不断发展，Xpert Ultra诊断TBM的准确度和敏感度也获得了进一步提高，但Xpert Ultra检测阴性仍不能完全排除TBM。为进一步提高确诊率，目前的研究建议：(1)若出现脑膜炎症状超过5 d，出现局灶性神经功能缺损，应怀疑TBM[51]。(2)胸部X线摄影显示粟粒性结核病或肺结核，脑部X线摄影显示脑梗塞、基底脑膜强化或脑积液，应怀疑TBM。(3)重点采集CSF和增加CSF采集量(>6 ml)，最大化检测样本中的MTB菌量，经3000×g离心15 min可提高诊断敏感度[12]。(4)如果CSF检测失败，应对其他可能涉及的部位进行诊断性检测，以寻找病原学证据。如痰液Xpert或尿液TB-LAM检测[39]。(5)当CSF表现为以淋巴细胞为主、低血糖、高蛋白等特点时，通常见于TBM，但应注意排除免疫抑制患者隐球菌性脑膜炎的可能[52]。(6)对常规抗生素治疗无效或诊断不明确的患者可在48～72 h后行重复腰椎穿刺，可能对提高确诊率具有一定的临床应用价值[39]。

2021年1月，世界卫生组织发布的NAAT检测结核病和耐药结核病的快速通讯表明：通过低、中、高复杂度自动化NAAT检测痰标本、呼吸道样本和MTB菌株对不同药物的耐药性是高度准确的[53]。但目前尚无以CSF为样本行上述三类NAAT的研究，宿主生物标志物和CSF抗原检测可能在TBM诊断中具有一定的发展前景。