构建基于全基因组数据的结核病耐药及传播监测网络

杨婷婷 高谦

结核病耐药监测可以了解患者中结核病耐药的程度、范围，揭示耐药变化趋势和耐药产生的影响因素。结核病传播监测则可以分析结核病近期传播的动态变化，揭示传播控制重点地区和人群，鉴定结核病的暴发事件，并对特定结核分枝杆菌流行菌株进行传播溯源等。结核病耐药与传播监测将为制定精准防控策略和合理分配卫生资源提供决策依据。笔者就构建基于结核分枝杆菌全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)数据的结核病耐药及传播监测网络提出以下拙见。

一、我国结核病耐药及传播监测现状

我国现行结核病监测体系包含结核病疫情监测和耐药监测。结核病疫情监测主要是通过传染病直报和专报系统，实时掌握全国结核病疑似患者和活动性结核病患者的情况，包括流动人口和结核分枝杆菌与HIV双重感染者。通过结核病患者个案信息网络电子化管理，现有监测体系能够实时了解并评价各地患者发现、治疗管理和规划活动的进展[1-2]。2007—2008年，我国采用分层整群抽样的方法，随机抽取全国31个省份(中国香港、澳门和台湾除外)共70个县(区)，首次组织了全国结核病耐药性基线调查工作[3]；从2015年开始，国家结核病参比实验室利用31个省的72个区县级结核病防治机构连续进行全国性结核病耐药性监测工作，并计划在此基础上建立覆盖288个监测点、区、县的结核病耐药监测网络[4]。

但是，我国目前的耐药监测体系在样本量和检测方法上仍存在一些问题。耐药监测主要基于抽样样本，目前每年约4000多株菌株，很难代表全国耐药现状。另外，采用表型药物敏感性试验(简称“表型药敏试验”)检测方法，存在样本转运困难、测试时间长、生物安全要求高、工作量大、不同实验室之间质量控制困难等问题[5]。

我国目前还几乎没有开展结核病传播监测工作，只有少部分地区利用数目可变串联重复序列(variable number of tandem repeats，VNTR)、IS6110和间隔区寡核苷酸分型(spacer oligonucleo-tide typing，Spoligotyping)等基因分型技术对收集的少量菌株进行分析。笔者在全国的几个研究现场开展了连续多年的基于VNTR分型的流行病学研究[6]，近年来也利用结核分枝杆菌WGS数据分析了这些现场结核病的传播规律[7-8]。但这些分子流行病学方法的应用目前仅停留在研究层面，并没有真正发挥监测作用。

二、基于WGS数据的结核病监测网络优势及国外现状

结核分枝杆菌WGS在结核病耐药和传播监测方面具有很大的优势。基于WGS预测的分子药敏与表型药敏试验检测结果相比，更加快速、全面、简便和稳定[9-10]。尽管目前分子药敏结果与表型药敏试验检测结果还不完全一致(特别是对一些二线抗结核药物)[11-12]，但作为耐药监测，只要采用相同的方法是可以反映耐药变化趋势的；同时，耐药监测对检测结果的反馈时间要求比临床诊断宽松，可以集中样本统一送样测序以降低成本，其费用低于表型药敏试验检测。

基于WGS的基因型分析比传统基因型分型技术(IS6110-RFLP、Spoligotyping和MIRU-VNTR等)具有更高分辨率，能够更准确地追踪特定菌株的传播和鉴定暴发事件[13]，为流行病学调查提供更可靠的线索[14]；WGS数据与患者流行病学数据结合可进一步分析传播的危险因素等(如传播的高危场所及人群)[8]；长期监测代表一个地区结核病近期传播的成簇率动态变化，可以反映该地区结核病传播控制的水平，同时可以用于评估控制策略的效果。此外，随着测序数据的积累，可以在全省甚至全国范围内监测伴随人口流动的结核分枝杆菌的传播和溯源，分析流动人口是在原籍感染还是到城市后感染发病，这对流动人口结核病防控政策的制定至关重要。

目前，英国、美国，以及欧洲一些国家已将WGS应用于结核病耐药和传播的监测，并取得了初步成果。英国在2017年率先宣布对英格兰(西欧结核病发病率最高的地区之一)的所有结核分枝杆菌菌株进行WGS，其结果用于结核病诊断、耐药性检测和菌株分型[15]。美国从2012年开始逐步推进使用WGS替代VNTR鉴定传播或暴发，并计划在2021年全部使用WGS进行成簇菌株鉴定[16]。自2015年以来，欧洲疾病预防控制中心(European Centre for Disease Prevention and Control，ECDC)一直支持将WGS应用于公共卫生预防的多试点研究和项目[17]。WGS的应用提高了英国的耐药检测速度，并提供了对结核病传播的准确判断以支持相关部门对成簇病例的调查[18]。EUSeqMyTB联盟[19]进行的一项分子流行病学研究表明，基于WGS的传播监测可以有效地显示欧盟(European Union，EU)或欧洲经济区(European Economic Area，EEA)国家的国内和跨境耐多药/利福平耐药结核病(MDR/RR-TB)传播情况[20]。随着WGS的成本不断下降，预计将有更多的国家把其纳入结核病监测规划。

三、SAM-TB平台的建立解决了测序数据分析瓶颈

对WGS产生的大量数据进行分析和解释是目前该方法应用的主要瓶颈之一[21]。WGS的常规分析流程及其产生数据的管理需要专门的生物信息学团队和高性能的服务器，而目前国内大多数结核病实验室尚不具备。同时，WGS数据分析目前仍缺乏一致的、国际公认的标准流程，不同的分析流程输出的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)数量和类型存在差异，对分析结果进行交叉比较和验证存在困难[22]。不同分析流程得到的结果不适合直接整合用于鉴定基因组簇(传播或暴发事件)[23]。因此，目前虽然已有多种分析工具可以进行结核分枝杆菌耐药预测和传播鉴定，但不同软件得到的结果难以直接整合。

为克服上述瓶颈，笔者与深圳市慢性病防治中心合作，建立了一个界面友好、操作简单、功能丰富的中英文结核分枝杆菌WGS分析平台——SAM-TB (http://samtb.szmbzx.com)。该平台基于Illumina测序获得的paired-end序列，对结核分枝杆菌样本进行全基因组变异(包括SNP和indel)分析和耐药突变鉴定，可以准确预测菌株对17种抗结核药品(异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、乙硫异烟胺、氧氟沙星、莫西沙星、链霉素、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素、对氨基水杨酸、环丝氨酸、利奈唑胺、氯法齐明、贝达喹啉和德拉马尼)的耐药性以及对4种一线抗结核药品的敏感性[24]；通过重建系统发育树和计算菌株间SNP距离分析菌株之间的遗传关系，鉴定代表近期传播的簇菌株；还可以鉴定非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)不同菌种，检测结核分枝杆菌和NTM混合样本。同时，该平台支持样本数据的批量上传、批量分析和分析结果的批量导出，方便国内外同道的使用。

四、建立基于WGS的结核病耐药和传播监测数据库

目前，在我国建立基于结核分枝杆菌WGS的结核病耐药和传播监测网络的条件已经成熟。首先，按照中国疾病预防控制中心要求，区县级结核病实验室都具备开展痰培养的能力，痰培养阳性菌株数量将越来越多。其次，国内相关企业的测序能力较强，测序方便、简单，只需将培养阳性菌株灭活后送往公司，公司提供菌株DNA提取、建库、测序服务，总费用在350元左右，并且价格还将下降。第三，SAM-TB数据分析平台的建立，使测序数据的分析统一、简便。因此，笔者建议应该尽快建立结核分枝杆菌临床菌株WGS数据库，数据库中包括结核分枝杆菌测序数据和与菌株对应的来自国家结核病专报系统的患者基本信息。同时，数据库具备数据统计分析及图形化展示功能，可以实时显示菌株对所有抗结核药物的耐药水平、变化趋势，以及结核分枝杆菌近期传播患者的分布和传播的热点区域，实现对结核病耐药和传播的监测。现阶段可以先建立省、市级的监测数据库，监测本省、市内结核病的耐药与传播。由于各省、市采用统一的数据来源(结核病专报网数据)和测序数据分析平台，待时机成熟即可较为容易实现全国数据共享，建成全国结核病耐药和传播监测网络。

五、因省制宜，逐步推进培阳菌株测序，发挥WGS监测网络优势

结核病耐药和传播监测网络是一个逐步建立的过程，数据积累越多，其作用就越大，但必须现在开始起步。考虑到各省、市经济水平的差异，笔者建议目前可以先将医疗机构培养阳性的菌株灭活后送省级机构统一保管(比运送和保存活菌简单、方便、安全)，根据经费状况将部分或全部灭活菌株交测序企业，由其负责DNA提取、建库、上机测序，最后提供质量可靠的测序数据。

另外，目前很多单位都在建立菌株样本库，有些单位也已经保留了很多菌株样本。由于活菌标本的保存、运送对生物安全的要求高，还需要大量的-80 ℃冰箱。因此，建议除非有明确的目的和完善的临床研究设计方案，才有必要和价值建立样本库。否则，笔者建议将所有菌株测序，建立数字菌株库，这样完全能够满足结核病耐药和传播监测及常规的研究需要。如暂时没有经费测序，则建议保留灭活的菌株，待有条件再行测序。

六、结语

随着我国结核病患者的痰培养的比例提高、WGS的成本快速下降，以及SAM-TB测序数据分析平台的建立，在我国建立基于WGS的结核病耐药和传播监测网络已经成为可能。以各省为单位逐步推进结核病耐药和传播监测网络的建设，实现实时监测耐药结核病的变化趋势、追踪结核病的传播与暴发，以提高我国结核病控制水平，刻不容缓。